Indukált pluripotens őssejtek tenyésztési protokolljai

• Bevezetés
• Módszerek
• A humán IPSCS krioprezerválása
• Tanácsok a hibaelhárításhoz
• Kapcsolódó termékek 

Bevezetés

Az indukált pluripotens őssejtek  (iPSC-k) képesek a test mindhárom csírarétegét képviselő differenciált utódokat létrehozni: Az ektoderma, az endoderma és a mezoderma. A humán iPSC-k in vitro kiterjesztésének és sejttípus-specifikus differenciálódási protokollok alkalmazásának képessége kritikus fontosságú a betegektől származó "betegség a tálban" sejtmodellek létrehozásához az őssejtkutatás és a gyógyszerkutatás alapkérdéseihez.

Ez a protokoll útmutató részletesen ismerteti a European Bank of induced pluripotent Stem Cells (EBiSC) által biztosított emberi iPSC-k felolvasztásának, tenyésztésének és krioprezerválásának lépéseit. Az emberi indukált pluripotens őssejt (iPSC) vonalak különböznek bármely más létrehozott sejtvonaltól. Ha nem ismeri az iPSC-k tenyésztését, olvassa el figyelmesen az alábbi utasításokat.

Főbb pontok a sikerhez

• A kezdés előtt olvassa el figyelmesen ezeket az utasításokat, beleértve a szükséges reagensekről, a felolvasztásról, a passzázsról, az óvintézkedésekről és a hibaelhárítási tippekről szóló szakaszokat.
• Győződjön meg arról, hogy minden szükséges reagens rendelkezésre áll a sejtek felolvasztása előtt.
• A megfelelő táptalaj és mátrix kombinációt használja. Az iPSC-k speciális táptalajt és tenyésztési körülményeket igényelnek.
• Győződjön meg arról, hogy a berendezést rendszeresen kalibrálják, és a reagensek nem jártak le.

Módszerek

A vizsgálati tanúsítvány (CofA) az egyes sejtvonalakra jellemző ajánlásokat tesz a sejtek médiában és mátrixban történő felolvasztására. Szükség esetén a használt mátrix és médium csak a passzázs során cserélhető alternatívára. A sejteknek időre lehet szükségük az alkalmazkodáshoz a  médium vagy mátrix megváltoztatását követően. A sejtek életképességére vagy minőségére vonatkozóan nem adható garancia, ha nem az ajánlott  szövettenyésztési rendszert használják.

Extracelluláris mátrix előkészítése

Bazális membrán kivonat (BME)

Az őssejtek által minősített ECM gélmátrix (CC131) egy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumorokból tisztított oldható bazális membrán kivonat (BME), amelyet előzetesen emberi ES/iPS sejtkultúrához minősítettek. A mátrix 20-40°C-on polimerizálódik, hogy rekonstruált bazálmembránt képezzen. A termék többek között laminint, kollagén IV-et, entaktint és heparán-szulfátot tartalmaz. A mátrix kiküszöböli az időigényes előszűrés és tételazonosítás szükségességét, optimális ECM-bevonatot biztosít a pluripotens humán ES/iPS sejtek hosszú távú tenyésztéséhez, és támogatja a humán ES/iPS sejtek tenyésztését több szérummentes/táplálékmentes humán ES/iPS sejt expanziós közegben (pl. mTeSR^®, PluriSTEM™). Az alábbiakban általános irányelveket olvashat a 6 lyukú lemezek bevonására vonatkozóan az őssejt-minősített ECM gélmátrix használatával.  Minden eljárást aszeptikus körülmények között, biológiai biztonsági szekrényben kell elvégezni.

1. A használat előtt egy nappal olvassa fel az ECM gélmátrixot (CC131) a 2-8°C-os hűtőszekrényben. Miután felolvasztotta, az ECM gélt mindig tartsa jégen, és használjon előhűtött táptalajt és pipettákat a termék gélesedésének elkerülése érdekében.
2. Hígítsa fel az ECM gélmátrixot (CC131). 1:80 arányban hideg DMEM/F12 (D6421) közeggel.  A szükséges mennyiségeknek megfelelően skálázza fel vagy le.  Az alábbiakban egy példa látható egy 6 lyukú lemez bevonására 1,5 ml 1:80 arányban hígított ECM géllel.
   Az 1:20-as hígításhoz adjunk 0,5 mL ECM gélt 9,5 mL hideg DMEM/F12 vagy DMEM közeghez egy 15 mL-es kúpos csőbe.  Teljes térfogat = 10 mL.
   A végső 1:80-as hígításhoz további 4-szeres hígításra van szükség.  Adjunk 2,5 mL 1:20-as hígítású ECM gélt 7,5 mL hideg DMEM/F12 közeghez.  Teljes térfogat = 10 mL
   MEGJEGYZÉS: Az ajánlott hígítás 1:80, azonban kívánság szerint több koncentrált Stem Cell Qualified ECM Gel is használható.
3. Adjon 1,5 ml 1:80 arányban hígított ECM gélmátrixot (CC131) egy 6 lyukú lemez minden egyes mélyedésébe.  Forgassa meg a tenyésztőlemezeket, hogy az ECM gélmátrix egyenletesen eloszoljon a lemez felületén.  Tárolja a 2-8 °C-os hűtőszekrényben egy éjszakán át vagy legalább 2 órán át a hűtőben használat előtt.  Ha nem használja fel azonnal, csomagolja be az ECM-mel bevont tenyésztőlemezeket parafóliába, és tárolja 2-8^°C-on a felhasználásig. Az ECM bevonatú tenyésztőlemezeket 3-4 napon belül használja fel.
4. A sejtek beültetése előtt 10-15 percre hozza vissza a lemezeket szobahőmérsékletre, távolítsa el a bevonóoldatot, és adjon hozzá 3 ml/lyuk humán ES/iPSC növekedési táptalajt (SCM130). A sejteket most már ki lehet ültetni az újonnan bevont lemezekre.

FONTOS:  Ne hagyja kiszáradni a lemezeket.

Vitronektin előállítása

1. A kézhezvételt követően tárolja a vitronektint (CC130) -80°C-on. Használat előtt olvassa fel a Vitronectin törzsoldatát szobahőmérsékleten, és készítsen 60 μL-es aliquotokat steril polipropilén csövekben. Az aliquotokat fagyassza le -80°C-on, vagy használja fel azonnal. Egy 60 μL-es aliquot elegendő egy 6 lyukú lemez összes furatának bevonásához.
2. A Vitronectin 0.5μg/cm², hígítsa a Vitronectint 1:100 arányban 6 mL szobahőmérsékletű PBS (D8537) és 60 μL Vitronectin óvatos összekeverésével. Adjon 1 mL hígított Vitronectint egy 6 lyukú lemez minden egyes mélyedésébe.
3. Inkubálja a bevont tenyésztőedényeket szobahőmérsékleten 1 órán át. Ha tárolásra van szükség, az edényeket le lehet zárni Parafilm^® (P7793) fóliával, és 2-8°C-on legfeljebb 3 napig tárolni. Használat előtt hagyja, hogy az edény 1 órán keresztül szobahőmérsékletre kiegyenlítődjön.
4. Az edény tenyésztéshez való előkészítéséhez távolítsa el a felesleges Vitronectint a tenyésztőedényből, és dobja el. A Vitronectin eltávolítása után nem szükséges a tenyésztőedényt kimosni.

Cellkultúra médiumok előkészítése

mTeSR™.-1 Media

1. Amelyik szükséges, vegye ki az mTeSR™1 kiegészítőt (5x) a fagyasztóból, és használat előtt egy éjszakán át olvassa fel 2-8 °C-on. Ne 37 °C-on olvassa fel.
2. Aseptikusan adjon 100 mL mTeSR™1 kiegészítőt (5x) 400 mL hideg (2-8 °C) alapközeghez.
3. Aliquotálja a táptalajt az 1 hetes tenyésztési munkához szükséges mennyiségekbe.
4. A teljes mTeSR™1 1 hétig 2-8 °C-on vagy 6 hónapig -20 °C-on tárolható. A fagyasztott teljes mTeSR™1 egyszer felolvasztható. Ne fagyassza le ismételten a felolvasztó közeget. Használat előtt melegítse fel az mTeSR™1-et szobahőmérsékletre. Ne hagyja a táptalajt szobahőmérsékleten napi 2 óránál hosszabb ideig, és kerülje a fényhatást, hogy elkerülje a táptalaj összetevőinek lebomlását.

Essential 8™ (TeSR™-E8) médium

1. Az E8 kiegészítőt (50x) szükség esetén vegye ki a fagyasztóból, és használat előtt egy éjszakán át olvassa fel 2-8 °C-on. Ne olvassa fel 37°C-on.
2. Aseptikusan távolítson el 10 ml E8 alapközeget, hogy 490 ml maradjon.
3. Adjon 10 ml E8-kiegészítőt (50x) a 490 ml hideg (2-8 °C-os) alapközeghez.
4. Aliquotálja a táptalajt az 1 hetes tenyésztési munkához szükséges mennyiségekbe.
5. A teljes E8 tárolható 2-8 °C-on 1 hétig vagy -20 °C-on 6 hónapig. A fagyasztott teljes E8 egyszer felolvasztható. Ne fagyassza le ismételten a felolvasztott tápfolyadékot. Használat előtt melegítse fel az E8-at szobahőmérsékletűre. Ne hagyja a táptalajt szobahőmérsékleten napi 2 óránál hosszabb ideig, és kerülje a fényhatást, hogy elkerülje a táptalaj összetevőinek lebomlását.

PluriSTEM^® Humán ES/iPSC médium

PluriSTEM^® médium (SCM130, SCM132) egy teljes, kis molekulákon alapuló, szérummentes médium, amely lehetővé teszi a humán ES/iPS sejtek feedermentes tenyésztését, és lehetővé teszi a médiumok kétnaponta történő cseréjét a morfológia vagy a hosszú távú funkcionalitás veszélyeztetése nélkül. A médium teljes értékű, és nem igényel további kiegészítést. Szükség esetén vegye ki a médiumot a fagyasztóból, és felhasználás előtt egy éjszakán át olvassa fel 2-8°C-on. Ne olvassa fel 37°C-on. A felolvasztás után a PluriSTEM^® médiumot 2-8°C-on kell tárolni, és két héten belül fel kell használni.

A humán iPSC-k kiolvasztása./h3>

1. A sejteket gyorsan fel kell olvasztani, a kriovialitást 37 °C-ra beállított vízfürdőbe helyezve. A gyors felolvasztás érdekében óvatosan forgassa meg a kriovialitást a vízfürdőben, de ne merítse alá a kriovialis kupakját. A krioampullát 70%-os etanollal (793213) vagy ezzel egyenértékű fertőtlenítőszerrel fertőtlenítse felbontás előtt.
2. Egy 5 ml-es steril pipetta segítségével a krioprotektáns/sejtek keveréket a krioampullából egy 15 ml-es centrifugacsőbe kell átvinni. Ügyelni kell arra, hogy a sejtek fizikailag ne sérüljenek.
3. Lassan, cseppenként adjon 10 ml megfelelő, szobahőmérsékletű tápfolyadékot a 15 ml-es centrifugázócsőben lévő sejtekhez. A 15 ml-es centrifugacsövet óvatosan ringassa előre-hátra, miközben cseppenként hozzáadja a tápfolyadékot. Ez egy fontos lépés, amely minimalizálja a sejtek ozmotikus sokkját, és segít biztosítani, hogy a sejteket a lehető legkíméletesebben kezeljük.
4. A cső ellenőrzése, hogy minden sejttartalom eltávolításra kerüljön. Ha szükséges, öblítse át 1 ml megfelelő tápfolyadékkal.
5. A sejtek kis mennyisége felhasználható a sejtszámlálás elvégzéséhez. Egyetlen sejtszuszpenziót kell létrehozni tripszin vagy más megfelelő sejtleválasztó közeg segítségével. Általános útmutatásként a beültetési sűrűségtartomány egy 6 lyukú lemez egy lyukához 2x10⁵ - 1x10⁶  életképes sejtek között van. Az adott EBiSC-sejtvonal tételszámára vonatkozó irányelveket lásd a CofA-ban.
6. Centrifugálja a sejteket 200 x g-n 2 percig. Távolítsa el és dobja el a felülúszót.
7. Készítse elő a tenyésztőedényeket megfelelő mennyiségű tápfolyadék hozzáadásával (például 1,5-2 ml egy 6 lyukú lemez egy lyukára).
8. Óvatosan kopogtassa meg a 15 ml-es centrifugacsövet a sejtpellet eltávolítása érdekében, majd óvatosan adjon hozzá 1 ml megfelelő tápfolyadékot és vetőmagot egy bevont 6 lyukú lemez 2 mélyedésébe (más tenyésztési formátumok használata esetén vagy ha az analitikai tanúsítványban másképp tanácsolják). Ne vegyen túl sok sejtet, mivel ez az egyetlen sejtszuszpenzió létrehozása miatt csökkent életképességhez vezet.
9. Óvatosan ringassa a lemezt oldalra és előre-hátra, hogy a sejtek egyenletesen eloszoljanak a lyukakban.
10. A sejtekről közvetlenül a felengedés után, 48 órán belül és körülbelül 70-80%-os  konfluencia esetén célszerű felvételeket készíteni.

A humán iPSC-k tenyésztése

1. Jó gyakorlat, ha az iPSC vonalakat naponta fáziskontraszt mikroszkópia (4x, 10x, 20x és 40x nagyítás) alatt figyeljük meg, hogy ellenőrizzük az iPSC-szerű morfológiát, a differenciált sejtek jelenlétét és a konfluenciát. Egy tipikus pontozás az alábbiakban vázolva:

Fokozat	Megnevezés
A		Optimális, tömörített iPSC kolóniák meghatározott szélekkel; a morfológia egységes a kolóniák között
B		Elfogadható iPSC kolóniák némi differenciálódással a széleken, a sejtek lazábban helyezkednek el a kolóniákon belül
	C		Jó tapadás, kis iPSC-kolóniák kialakulásával
D	Gyenge tapadás és nincs látható iPSC

1. ábra. Az iPSC kolóniák pontozása

2. ábra. Differenciálódási szintek az iPSC-kultúrákban

2. A sejtek táplálása úgy történik, hogy a tápfolyadék ~95%-át eltávolítjuk a lyukakból egy aspirációs pipetta segítségével. Ne távolítsa el teljesen a tápfolyadékot; a sejtek kiszáradásának elkerülése érdekében a sejtréteget egy vékony tápfolyadékfilmnek kell fednie.
3. A 6 lyukú lemez 1 lyukához 2 ml friss tápfolyadékot adjon hozzá óvatosan a lyuk oldalához. Inkubáljuk a sejteket 37 °C/ 5% CO₂ mellett.
4. Tipikusan a közegcserék naponta történnek a hét napból hat napon, megnövelt mennyiségű közeggel (a normál mennyiség 1,5x-2x-szerese; sejtsűrűségtől függően), ha a sejteket hosszabb ideig kell hagyni a közegcserék között. Ne lépje túl a két napot a közegcserék között.

A humán iPSC-k passziválása

EZ-LiFT™. Reagens Passaging Protocol

1. Az EZ-LiFT™ Reagens (SCM139) 37°C-ra melegítése előtt.
2. Légtelenítse a táptalajt, és mossa ki a kutakat kétszer 1.5 ml EZ-LiFT™ Reagenssel (SCM139).
3. Adjon 1 ml EZ-LiFT™ reagens (SCM139) minden egyes üregbe.  Inkubálja a lemezt 37°C-on 4 percig. 
4. 4 perc elteltével gyorsan kopogtassa meg a lemez alját (i.e. 20-25 kopogtatás 5 másodperc alatt). 
5. Tegye vissza a lemezt a 37°C-os inkubátorba további 4 percre.
6. 4 perc elteltével gyorsan kopogtassa meg a lemez alját (i. e. 20-25 kopogás 5 másodperc alatt).
7. Végezze el a mélyedések gyors ellenőrzését mikroszkóppal.
   1. A lemez alján lévő mélyedéseken a mikroszkópos vizsgálatot végezze el. Ha jelentős számú levált csomó látható, folytassa a 8. lépéssel.
   2. Ha nem figyelhető meg nyilvánvaló leválás, ismételje meg a 4-7. lépést, kivéve, hogy az 5. lépésben a 37°C-os inkubációnak
      4 perc helyett 2 percig kell tartania.  Folytassa a 8. lépéssel.
8. Óvatosan gyűjtse össze a sejtszuszpenziót (~1 ml), és tegye át egy 15 ml-es kúpos csőbe.  Semlegesítse 5 mL táptalajjal úgy, hogy óvatosan hozzáadja a táptalajt a sejtszuszpenzióhoz.  Ne pipettázzon fel és le, mivel ez a sejtcsomókat egysejtes szuszpenzióvá bonthatja.
9. Centrifugáljon 800 rpm-en 3 percig. Szívja le a felülúszót.
10. Óvatosan szuszpendálja újra a sejtpelletet 1 ml olyan médiumban amely támogatja a pluripotenciát, például PluriSTEM^® (SCM130).  Ne pipettázzon fel és le kétszeresnél többször.  A túlzott pipettázás egyes sejtek disszociációját eredményezheti. 
11. A disszociált sejtcsomókat újonnan bevont 6 lyukú lemezekbe adagolja. Az osztási aránynak 1:6 és  1:30 között kell lennie. Naponta ellenőrizze a sejteket. A sejtek jellemzően 6-8 nap alatt érik el a 60-80%-os konfluenciát, az osztási aránytól függően.

Az akkutáz passzázs protokoll

1. Aliquot elegendő PluriSTEM^® (SCM130), Accutase (A6964) és DMEM/F12 (D6421) a sejtek passzázsához. Melegítse a reagenseket szobahőmérsékleten.
2. Egy órával a sejtek passzázsának megkezdése előtt adjon ROCK-inhibitort (ROCKi), Y-27632-t (SCM075) a 6 lyukú lemez minden egyes mélyedésébe 10 μM végső koncentrációban.
3. 1 óra elteltével boncmikroszkóppal vizuálisan vizsgálja meg a passzázsra szánt humán pluripotens sejteket tartalmazó lemezt. Távolítsa el a spontán differenciálódó területeket.
4. Légtelenítse a sejteket tartalmazó tápfolyadékot a mélyedésből kikapart területekről. Öblítse ki 2 ml/lyukankénti DMEM/F-12 (D6421) tápfolyadékkal vagy 1X PBS (D8537) közeggel.
5. Légtelenítse és helyettesítse 1 ml Accutase (A6964) oldattal egy 6 lyukú lemez minden egyes mélyedésén. Inkubálja 37°C-on 8-10 percig.
6. Hűtse le az Accutase reakciót 1 mL PluriSTEM^® médium (SCM130) hozzáadásával minden egyes mL felhasznált Accutase-hoz. Óvatosan oldja le a sejteket egy steril 1000 μL-es pipettahegy segítségével.
7. A disszociált sejteket gyűjtse össze egy 15 ml-es kúpos csőbe. Öblítse át a lyukakat további 2 mL PluriSTEM^® médiummal (SCM130) a visszamaradt sejtek összegyűjtéséhez. Adja az öblítést a 15 ml-es kúpos csőbe.
8. Centrifugálja a 15 ml-es kúpos csövet, amely a sejtszuszpenziót tartalmazza, 300 x g-n 5 percig szobahőmérsékleten.
9. A felülúszót légtelenítse. Reszuszpendálja a sejteket friss PluriSTEM^® médiumban (SCM130)  10 μM ROCK-gátlót, Y-27632-t (SCM075) tartalmazó 10 μM ROCK-gátlót tartalmaz.
10. Számolja meg a sejtek számát Scepter™ sejtszámláló vagy hemocitométer segítségével. Győződjön meg arról, hogy a sejtek egyetlen sejtszuszpenzióban vannak. Határozza meg a sejtek életképességét Trypan Blue (T8154) kizárással.
11. Állítson be egy titrálást különböző sejtsűrűségű, 0,5 -1x10⁴ sejtek/cm² közötti tartományban. Ez 50 000-100 000 sejtnek felel meg egy Matrigellel bevont 6 lyukú lemez egy lyukában, PluriSTEM^® médiumban, amely 10 μM ROCK-inhibitort tartalmaz.
12. Másnap cserélje ki friss PluriSTEM^® médiummal (SCM130). Cserélje ki friss PluriSTEM^® médiummal (SCM130) 2 naponta (3 ml térfogat kútonként). A sejtek 5-7 naponként passziválhatók.

Diszpáz passzázs protokoll

1. Aliquot elegendő Dispase II, 1 mg/ml (
2. a href="/product/mm/cc130">CC130) és DMEM/F12 (D6421) a sejtek passzázsához. Melegítse a reagenseket szobahőmérsékleten.
3. A passzázsra szánt humán pluripotens sejteket tartalmazó lemez vizuális vizsgálatához használjon boncmikroszkópot. Vizsgálja meg a telepeket a spontán differenciálódó területek szempontjából.
4. Használjon egy steril p200 pipettahegyet egy p200 pipettázóhoz csatlakoztatva a spontán differenciálódó területek lekaparására.
5. Az üregből lekapart területekről a sejteket tartalmazó tápfolyadékot légtelenítse. Öblítse ki 2 ml/lyukankénti DMEM/F-12 (D6421) táptalajjal vagy 1X PBS (D8537) táptalajjal.
6. Adjunk 1 ml Dispase II-t, 1 mg/ml (CC130) a passzázsra szánt pluripotens humán ES vagy iPS sejteket tartalmazó 6 lyukú lemez minden egyes mélyedésébe.
7. 37°C-on inkubáljuk 6-7 percig. Az inkubáció után mikroszkóp alatt vizuálisan vizsgálja meg a telepeket. A telepek szélei kissé lekerekítettnek és/vagy a lemez felületétől elhajlónak tűnhetnek, de a telepek többségének még mindig a lemezhez kell kapcsolódnia.
8. Légtelenítse a Dispase II-t (CC130), és óvatosan öblítse át minden egyes mélyedést kétszer 2 ml 1X PBS-szel (D8537) vagy DMEM/F12 (D6421) közeggel.
9. Adjon 1,5-2 ml PluriSTEM^® médiumot (SCM130) minden egyes mélyedésbe. Óvatosan válassza le a telepeket egy sejtkaparó segítségével.
10. Egy 5 ml-es szerológiai pipettával gyűjtse össze a sejtaggregátumokat egy 15 ml-es kúpos csőbe. Minimalizálja a fel-le pipettázást, mivel ez a telepeket szuboptimális kis darabokra törheti.
11. Öblítse át a kutakat további 2 mL PluriSTEM^® médiummal (SCM130) kutanként, hogy összegyűjtse a maradék sejtaggregátumokat. Adja az öblítést a 15 ml-es kúpos csőbe.
12. Centrifugálja a sejtaggregátumokat tartalmazó 15 ml-es kúpos csövet 300 x g-n 5 percig szobahőmérsékleten.
13. A felülúszót légtelenítse. Reszuszpendálja a sejtaggregátumokat megfelelő mennyiségű PluriSTEM^® médiumban (SCM130) a passzázshoz. Ossza fel a sejteket 1:3-1:6 arányban, a sejtcsomók számától függően.
14. Tegye a lemezt 37 °C-os inkubátorba. Mozgassa a lemezt óvatosan oldalról oldalra és előre-hátra, hogy a sejtaggregátumok egyenletesen eloszoljanak a mélyedés felszínén.
15. Másnap cserélje ki üregenként 3 ml friss PluriSTEM^® médiummal (SCM130). A sejtek 5-7 naponként passziválhatók.

A humán iPSC-k kriokonzerválása

1. Tartsa meg a reagenseket és a fagyasztótartályt (pl.pl. Mr. Frosty) a krioprezerválási eljárás alatt hűtve.
2. A sejteket akkor kell krioprezerválni, amikor a növekedés log fázisában vannak, hogy a felolvasztáskor a túlélést fokozzák. A betakarítás optimális időpontja általában akkor van, amikor a sejtek körülbelül 70-80%-ban konfluensek
3. A felhasznált krioprotektív közeg típusa a tenyésztési körülményektől és a laboratóriumi preferenciáktól függ. Használjon a kereskedelmi forgalomban kapható Cryostor^® CS10 (C2874 CS10/a>) vagy DMSO (D2650) alapú fagyasztókeveréket (10% DMSO FBS-ben és táptalajban).A  Cryostor^® médiumot felhasználásra készen szállítjuk, és 2-8°C-on tároljuk. A DMSO alapú krioprotektív készítéséhez keverjen 40% FBS-t 10% DMSO-val, majd keverje össze 50% megfelelő táptalajjal.
4. Vegye ki az elhasznált táptalajt a szövettenyésztő edényből, és mossa át az edényt kétszer a tenyésztési körülményektől függően ajánlott mennyiségű mosópufferrel (A Cultrex/Matrigel mosópuffer 0.5mM EDTA; a Vitronectinhez a mosópuffer a PBS).
5. A sejtek kiemeléséhez a szövettenyésztő műanyagból adjon 1 ml 0,5mM EDTA-t (03690) a szövettenyésztő edénybe. Inkubálja a sejteket az ajánlott ideig és hőmérsékleten, a használt mátrixtól függően. Szívja le az EDTA-t a lyukból. Vigyázni kell, hogy a telepek nagyon lazán kötődjenek a műanyaghoz.
6. Adjon hozzá 1 ml krioprotektálószert mélyedésenként. Óvatosan mossa át a krioprotektálószert az edényen 1 ml steril pipettával, hogy a sejtek leváljanak a műanyagról. Ne szívjon 3 alkalomnál többször, hogy elkerülje a sejtcsomók egyes sejtekre történő szétválását. Helyezze a krioprotektálószert és a sejtkeveréket egy megfelelően felcímkézett krioampullába.
7. Ha több mélyedés krioprezerválására van szükség, akkor az azonos passzázsszámú és azonos tenyésztési körülményekből származó sejteket össze kell vonni. Az összevont sejtek egy aliquotja felhasználható a sejtek számolásához. Centrifugálja a kinyert sejteket 2 percig 200xg-nél, szívja le a kiürült tápfolyadékot, és óvatosan szuszpendálja újra a sejtpelletet megfelelő mennyiségű krioprotektálószerben. Egy 6 lyukú lemez egy mélyedéséből kb. 1-2 x 10⁶ 1-2 x 10⁶ sejtek keletkeznek. Kriovialánként körülbelül 1-2 x 10⁶ -nyi sejtet ajánlott lefagyasztani. Használjon 1 mL krioprotektáns-sejtkeveréket krioampullánként.
8. A krioampullákat azonnal helyezze egy előhűtött (2-8°C) Mr. Frosty kádba, majd a Mr. Frosty kádat azonnal helyezze át egy -80°C-os fagyasztóba. Hagyja a sejteket egy éjszakán át (16-36 óra) -80°C-on maradni. Ha a sejteket lefagyasztották, szárazjégen helyezze át őket egy ultraalacsony hőmérsékletű tárolóedénybe (folyékony introgen vagy -150°C-os fagyasztó).

A humán iPSC-k jellemzése

Az iPSC-k differenciálatlan állapotát az alkalikus foszfatáz (SCR004) és az őssejt transzkripciós faktorok Nanog, Oct-4 és Sox-2 magas szintű expressziója jellemzi. Ezek a sejtek a stádium-specifikus embrionális antigén (SSEA1, 3, 4) és a podokalyxin (TRA-1-60, TRA-1-81) markerek kifejeződése tekintetében is markáns eltéréseket mutatnak egér társaiktól. A sejtek ellenanyagos ICC-festéssel elemezhetők az őssejt-karakterizációs készletek (SCR001, SCR002, SCR078) vagy PCR analízissel.

1. táblázat. Az emberi iPSC markerek összefoglalása

Cellatípus	Alkalikus foszfatáz	Oct-4	Sox-2	Nanog	SSEA-1	SSEA-4	TRA-1-60	TRA-1-81
Humán iPSC	+	+	+	+	+	+	+<	-	-	-

3. ábra. A pluripotens iPS-sejtek pluripotenciális markereket fejeznek ki. Alkalikus foszfatáz (40x) (A), Oct-4 Alexa 488 (MAB4401A4, 400x) (B), Sox-2 Cy3 (MAB4423C3, 100x) (C), Nanog Alexa 488 (MABD24A4, 400x) (D), TRA-1-60 Cy3 (MAB4360C3, 100x) (E) és TRA-1-81-Cy3 (MAB4381C3, 100x) (F). A sejtmagokat DAPI-val (kék) (D9542) ellenfestettük.

 

Tanácsok a hibaelhárításhoz

probléma	megfigyelés	megoldás
Az iPSC-k alacsony életképességebr /> felolvasztás után	- A helyreállítást követő 4 napon belül kevés vagy egyáltalán nem látható kolónia		- Gondoskodjon arról, hogy a kriovialitásokat gyorsan felolvasztja, és a tápfolyadékot nagyon lassan (cseppenként, a cső óvatos kavargatása közben) - 10μm ROCK-inhibitort adjon a felolvasztáskor, de ne használja rutinszerűen .br /> - Győződjön meg arról, hogy a sejteket a növekedés log fázisában, alacsony differenciálódási szint mellett bankolták - Hagyja a kis kolóniákat robusztus növekedésig növekedni, és alacsony osztási arány mellett passzírozzon (1:1 vagy 1:
alacsony életképesség a passzázs után	- A sejtek nem kötődnek megfelelően - Atipikus morfológia - Magas sejtmortalitás - A sejtek nem szaporodnak	- Használjon alacsonyabb osztási arányt és tartson fenn konfluensebb tenyészetet - Biztosítsa, hogy a sejtek log fázisban legyenek a növekedés során a passzázs során - Dolgozzon gyorsan vagy csökkentse az EDTA inkubációs idejét, mivel a csomók méretét befolyásolhatja a túl hosszú EDTA expozíció - Növelje az EDTA inkubációs idejét, ha a sejtek nem válnak le könnyen. Ezzel elkerülhető, hogy a sejteket túl turbulens módon kelljen öblíteni, és ezáltal túl kicsi aggregátumokat vagy egysejtes szuszpenziót hozzon létre - Ellenőrizze, hogy a lemezeket helyesen vonták-e be, a mátrix a lejárati időn belül van-e, és ellenőrizze a gyártási tételt a gyártóval, ha ez a probléma rendszeresen előfordul, és más okokat kizártak
Spontán differenciálódás	- A kolóniáknak nincsenek meghatározott széleik - A kolóniáknak nincsenek meghatározott szélei - A telepeken belüli sejtek kevésbé kompaktak - A sejtek lapítottnak és nagynak vagy fibroblasztikusnak tűnnek		- Győződjön meg arról, hogy a sejtek tenyésztése az ajánlások (i.azaz a sejtek napi etetése) - Biztosítsa, hogy a reagensek frissen legyenek elkészítve (azaz két héten belül használják fel) - Kerülje a lemezek inkubátoron kívül hagyását, hogy minimalizálja a hőmérséklet-ingadozást és a fénynek való kitettséget. - Csökkentsük a kolónia sűrűséget azáltal, hogy kevesebb sejtaggregátumot ültetünk el cm2 enként a passzázs során - Ha a differenciált területek között jó iPSC kolóniák maradnak fenn, megfontolandó a jó iPSC morfológiájú kolóniák kézi szedése pipettahegy segítségével. Javasolt több kolóniát kiválasztani, és egy pipettahegy segítségével metszeni, kiemelni, leszívni, majd egy friss 1:6-os üregbe passziválni. - A differenciált sejtek eltávolítása a differenciált területek pipettaheggyel történő lekaparásával, az iPSC-kolóniák érintetlenül hagyásával is megfontolandó. Ügyelni kell arra, hogy ne zavarjuk meg az iPSC-kolóniákat, és ne kaparjunk le túl sokat a mátrixrétegből ebben a folyamatban.
A telepek nem egyenletes eloszlása a lemezen belül ./td>	- Olyan területek, ahol túl nagy az iPS-sejtek sűrűsége. A lemez felületének jelentős területein kevés vagy egyáltalán nincs telep.		- Győződjön meg arról, hogy a szövettenyésztő edény teljes felülete egyenletesen be van vonva a megfelelő mátrixszal - Biztosítsa, hogy a sejtaggregátumok egyenletesen eloszlanak . a lemez óvatos előre-hátra és oldalirányú ringatásával - Vigyázzunk, amikor a lemezt az inkubátorba helyezzük, és hagyjuk 24 órán keresztül zavartalanul
A jelentős kaparás abr /> szükséges a sejtek eltávolításához	- A telepek nem válnak le a lemezről 2-3 1 ml-es pipettával történő öblítés után	- Az 1 ml-es pipettával történő öblítés után	- Győződjön meg arról, hogy az EDTA inkubációs ideje és hőmérséklete összhangban van a mátrixszal - Növelje az EDTA inkubációs idejét - Ne hagyja, hogy a sejtek 70%-nál jobban összefolyjanak - Ne hagyja, hogy a telepek belseje túlnőjön. Néha szükséges egy kevésbé konfluens, kevesebb, de robosztus telepeket tartalmazó lemez passzázsát elvégezni, alacsonyabb osztási arányt használva
Nagyon gyenge kötődés és a sejtpusztulás jelentős növekedése a passzázs után	- A sejtek elkezdenek kiemelkedni a lemezről, annak ellenére, hogy úgy tűnt, hogy a passzázs után azonnal rögzülnek		- A tápfolyadék cseréje helyett töltse fel a kutakat friss tápfolyadékkal a megfelelő tápanyagkoncentráció biztosítása érdekében, és hagyja a sejteket további 24 órán keresztül zavartalanul, hogy az aggregátumok teljesen rögzülhessenek - Nagyon óvatosan cserélje a tápfolyadékot. Ne tegyük ki a kolóniákat túlzott nyíróerőnek a tápfolyadék gyors hozzáadásával