Fehérje és nukleinsav kölcsönhatások
1. ábra.A sejteket és a DNS-fehérje kölcsönhatásokat érintő tudományos folyamat sematikus ábrázolása. A bal felső képen a "sejtek" "keresztkötésen" és "lízisen" mennek keresztül, amelynek eredményeként fehérjék és DNS keveréke keletkezik. Ez a keverék ezután "Antitest-kötésen" megy keresztül. Az ezt követő lépések közé tartozik a "Keresztkötés visszafordítása", több "Mosási lépés" és az immunprecipitáció. Végül az alsó szekvencia a "DNS-tisztítás és kvantitatív PCR", a DNS és a fehérje elemzését mutatja be.
A fehérjék a sejtekben található munkamolekulák, amelyek a sejtek működéséhez és túléléséhez szükséges számtalan biológiai tevékenységért felelősek. Érdekes módon a fehérjék változatos csoportja a DNS-sel is kölcsönhatásba lép. A kromoszómáinkon belül a DNS gyakran szorosan a fehérjék köré van kötve, amelyeket a kromoszómán belül kromatidának neveznek. Ezek a fehérje-DNS kötegek segítenek a DNS-t kompakt formába csomagolni a sejtmagban. Hatékony molekuláris eszközöket és technikákat fejlesztettek ki a kutatók, hogy ezeket a fehérje-DNS-kötegeket és más DNS-kötő fehérjekomplexeket izolálják további downstream alkalmazásokhoz.
Immunoprecipitáció
Az RNS- és DNS-kötő fehérjékhez (pl.pl. transzkripciós faktorok) segítségével a tudósok értékelhetik a molekuláris útvonalak szabályozását, és jobban megérthetik a génműködést mind az egészséges, mind a beteg szövetekben.
A fehérje-RNS és fehérje-DNS kölcsönhatások vizsgálatára jelenleg számos technológia és módszer áll rendelkezésre, amelyek alkalmasak további downstream elemzésekre. Például, chromatin immunprecipitációs (ChIP) próbákat gyakran használják transzkripciós faktor-DNS kölcsönhatások vizsgálatára génexpressziós és epigenetikai módosítási vizsgálatokhoz. Míg, RNS-precipitációs (RIP) próbák általában mRNS-ekhez, nem kódoló RNS-ekhez, miRNS-ekhez és vírusos RNS-ekhez kötődő fehérjék vizsgálatára használják. Az immunprecipitációs vizsgálatok közös kihívása az ellenanyag specifitása és/vagy hozzáférése a kívánt fehérjéhez. E problémák némelyikének megkerülése érdekében a kutatók rekombináns fehérje-technológiát alkalmaznak, hogy egyedi címkékkel módosított fehérjéket fejtsenek ki, mint például a hemagglutinin (HA) tag, amelyeket a megfelelő antitest nagy specificitással ismer fel.
Proximity Ligation Assay Technology
A fehérje-DNS technológiákat kihasználó tudósok új eszközöket és módszereket dolgoztak ki a fehérje-fehérje kölcsönhatások értékelésére. Nagy specificitással és érzékenységgel, proximity ligation assay (PLA) technológia megkönnyíti in situ az endogén fehérjék, fehérjemódosítások és fehérje kölcsönhatások kimutatását. Az immunprecipitációs technikákhoz hasonlóan a PLA-teszt is rendkívül specifikus primer antitesteket használ a két keresett fehérje felismerésére. A PLA-szondaként funkcionáló, módosított oligonukleotiddal jelölt másodlagos antitesteket használnak azonban az elsődleges antitestekhez való kötődéshez. Csak ha mindkét fehérje jelen van és a közelben van, a hibridizáló konnektoroligók csatlakoznak a PLA-szondákhoz. A ligáz hozzáadásával zárt, körkörös DNS-templát képződik. Az újonnan kialakított körkörös DNS-templát kialakításával a gördülő körös amplifikáció már lehetséges a DNS-polimeráz hozzáadásával, és végül egy nagymértékben felerősített jelet hoz létre, amely a PLA-szondához kötődik. A megfelelő fehérje és nukleinsav kölcsönhatási technológia kiválasztását nagymértékben a kutató későbbi alkalmazási igényei határozzák meg.
Kapcsolódó műszaki cikkek
- Learn how Proximity Ligation Assay technology works and how the protein-protein interaction control kit can confirm in situ detection of EGF-induced EGFR-HER2 dimerization.
- Peptide synthesis up to 200 amino acids with HPLC purification, offering various purity levels, scales, and modifications.
- RNA Immunoprecipitation (RIP) is an essential method for analyzing proteins that interact with and modify the function of mRNAs, small RNAs, viral RNAs, or lncRNAs.
- Duolink® PLA Multicolor technology and the quantification of protein-protein interactions in fixed tissues and cells.
- Support information including tips and tricks, frequently asked questions, and basic troubleshooting.
- Mindent látni (26)
Kapcsolódó protokollok
- This protocol describes how to perform immunofluorescent detection of proteins in cells and tissue.
- Duolink® kits use in situ PLA® technology for accurate quantification of individual proteins, interactions, and modifications in cells and tissue.
- The video follows the simple and straightforward procedure that allows you to detect, quantify and obtain cell localization of protein interactions and their modifications in a single experiment.
- Ez az oldal azt mutatja be, hogyan tisztítsa vagy távolítsa el a DNS-kötő fehérjéket a Cytiva Heparin Sepharose High Performance, Heparin Sepharose 6 Fast Flow, Capto Heparin segítségével.
- Mindent látni (18)
További cikkek és protokollok keresése
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?