Kvantitativní detekce PCR (formálně kvantitativní PCR v reálném čase, qPCR) vychází ze základní techniky PCR a umožňuje výzkumníkům odhadnout množství výchozího materiálu ve vzorku. Vzhledem k tomu, že produkty jsou detekovány v průběhu reakce, má qPCR mnohem širší dynamický rozsah analýzy než konvenční, end-point PCR; v rámci jednoho běhu lze detekovat od jedné kopie až po přibližně 1011 kopií. Kvantitativní PCR v reálném čase a následná detekce amplikonů se provádí ve formátu uzavřené zkumavky, což eliminuje potřebu manipulace po PCR, jako je například gelová elektroforéza, a výrazně snižuje riziko křížové kontaminace.
Základní principy qPCR jsou popsány na této stránce a mechanismy běžných detekčních chemikálií jsou popsány v Metody kvantitativní PCR a digitální PCR detekce.
Základní principy
Při provádění qPCR se používá fluorescenční reportérové barvivo jako nepřímé měřítko množství nukleové kyseliny přítomné během každého amplifikačního cyklu. Nárůst fluorescenčního signálu je přímo úměrný množství exponenciálně se hromadících molekul produktu PCR (amplikonů), které vznikají během opakujících se fází reakce (viz Polymerase Chain Reaction). Reportérové molekuly se dělí na; barviva vázající dvouvláknovou DNA (dsDNA), barviva konjugovaná s primery nebo další oligonukleotidy konjugované s barvivem, označované jako sondy (Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods).
Použití barviva vážícího dsDNA, jako je SYBR® Green I, představuje nejjednodušší formu detekční chemie. Pokud je barvivo SYBR Green I volné v roztoku nebo je přítomna pouze jednořetězcová DNA (ssDNA), vyzařuje světlo s nízkou intenzitou signálu. S postupem PCR a zvyšujícím se množstvím dsDNA se na amplikony váže více barviva, a proto se zvyšuje intenzita signálu.
Alternativně může sonda (nebo kombinace dvou v závislosti na detekční chemii) přidat úroveň specifičnosti detekce nad rámec barviva vážícího dsDNA, protože se váže na specifickou oblast templátu, která se nachází mezi primery. Nejčastěji používaným formátem sondy je sonda s dvojím značením (DLP; označovaná také jako hydrolyzovaná nebo TaqMan® sonda). DLP je oligonukleotid s 5' fluorescenční značkou, např. 6-FAM™, a 3' zhášecí molekulou, jako je jeden z tmavých zhášečů, např, BHQ®1 nebo OQ™ (Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods). Tyto sondy jsou navrženy tak, aby hybridizovaly s templátem mezi dvěma primery, a používají se ve spojení s polymerázou DNA, která má vlastní 5' až 3' exonukleázovou aktivitu. Když je DLP volná v roztoku, intenzita signálu je nízká, protože reportérové barvivo je v těsné blízkosti zhášecího prvku. Jakmile se během reakce vytvoří větší množství templátu, hybridizuje k templátu více sond, které jsou následně štěpeny 5' až 3' exonukleázovou aktivitou postupující DNA polymerázy. Intenzita fluorescenčního signálu se zvyšuje s uvolňováním 5' reportérového barviva do roztoku. Použití sond značených různými reportérovými barvivy umožňuje současnou detekci a kvantifikaci více cílů v jedné (multiplexní) reakci.
Typický průběh qPCR se skládá z opakovaných cyklů střídavých teplotních inkubací, Postup cyklického vyšetření 3.1. Tento profil se často používá v případě, že jsou pro qPCR zvoleny detekční chemikálie vázající dsDNA, molekulární majáky nebo sondy Scorpion® Probes. Extenze primerů je nejúčinnější při teplotě 72 °C, protože to je optimální teplota pro procesivitu většiny DNA polymeráz. Při teplotě 72 °C probíhá polymerace rychlostí přibližně 100 bází za sekundu. Nicméně i při nižších teplotách existuje procesivita, která je dostatečná pro amplifikaci kratších templátů. Amplikony qPCR jsou obvykle kratší (<200 bází) než běžné produkty PCR, a proto se při práci s dvojznačně značenými probémy (cyklický postup 3.2) často kombinuje extenze s žíháním v jediném kroku při 60 °C.
Cyklický postup 3.1
Příklad standardního profilu qPCR s použitím barviva vázajícího dsDNA, Molecular Beacon nebo Scorpions® detekce sond.
- Počáteční denaturace: Teplota reakce se zvýší na 95 °C a vzorek se inkubuje 2-10 minut (doba závisí na mechanismu horkého startu enzymu polymerázy), aby se zajistilo, že všechny komplexní cíle (dsDNA) jsou odděleny a jsou jednovláknové a dostupné pro amplifikaci
- Cyklování:
- Denaturace: Teplota reakce se zvýší na 95 °C po dobu 10 s, aby se roztavila veškerá dsDNA.
- Annealing: Teplota se sníží na 60 °C na 30 s, aby se podpořila vazba primeru a sondy (pokud je součástí) na templát.
- Extenze: Následná elongace probíhá při zvýšené teplotě 72 °C, která je optimální pro procesivitu TaqDNA polymerázy. Doba trvání extenze bude záviset na velikosti amplikonu (30 s na 1 kb). Doba elongace závisí na požadované délce amplikonu a použitém enzymu. Vzhledem k tomu, že amplikony qPCR jsou krátké, je to obvykle 5-30 s.
- Denaturace: Teplota reakce se zvýší na 95 °C po dobu 10 s, aby se roztavila veškerá dsDNA.
- Pakování: Kroky 1-3 se opakují, obvykle po dobu 40 cyklů.
Cyklování-procedura 3.2
Příklad dvoukrokového cyklického profilu qPCR pro detekci DLP.
- Počáteční denaturace: Teplota se zvýší na 95 °C a reakce se inkubuje 2-10 minut (v závislosti na vlastnostech enzymu polymerázy s horkým startem)
- Cyklování:
- Denaturace: Teplota reakce se zvýší na 95 °C na 10 s, aby se roztavila veškerá dsDNA.
- Annealing a extenze: Teplota se sníží na 60 °C na 30 s, aby se podpořila vazba primeru na templát a následně došlo k elongaci díky dostatečné aktivitě DNA polymerázy při této teplotě.
- Pakování: Kroky 1-2 se opakují, obvykle po 40 cyklech.
Změna fluorescence v průběhu reakce se měří pomocí termálního cyklovače PCR v reálném čase. Specializované přístroje pro PCR v reálném čase kombinují teplotní cyklování s optickou jednotkou. Optická jednotka poskytuje světlo o vhodné vlnové délce k excitaci fluoroforu a detekuje výslednou emisi. Mnoho moderních přístrojů má připevněnou obrazovku nebo blízký počítačový monitor, který umožňuje sledovat průběh reakce (obrázek 3.1).
Obrázek 3.1.Příklad dat z qPCR testu. A) Různé fáze reakce. Základní linie: Počáteční koncentrace templátu je nízká, proto je intenzita fluorescence příliš nízká na to, aby mohla být detekována, a je patrný pouze signál pozadí. Exponenciální: Poté, co výtěžek cílové látky dosáhne detekčního prahu, znázorněného červenou prahovou čárou, lze průběh reakce sledovat prostřednictvím exponenciální fáze. Lineární: S rostoucí koncentrací templátu se snižuje dostupná koncentrace DNA polymerázy a rychlost reakce klesá. Plateau: Reakce je na maximální výtěžnosti. B) Jednotlivé reakce jsou charakterizovány cyklem, při kterém fluorescence poprvé stoupne nad prahovou hodnotu, což se označuje jako kvantifikační cyklus (Cq). Pokud je výchozí materiál hojný, amplifikace je pozorována v dřívějších cyklech a Cq je nižší. Pokud je výchozího materiálu málo, amplifikace je pozorována v pozdějších cyklech a Cq je vyšší. Tato korelace mezi fluorescencí, Cq a množstvím amplifikovaného produktu umožňuje kvantifikaci templátu v širokém dynamickém rozsahu.
Kvantifikace a analýza cílů gDNA
Kvantitativní PCR v reálném čase lze snadno použít k analýze cílů gDNA. Takovými studiemi může být stanovení genotypů/SNP
, analýza metylace, screening transgenních sekvencí nebo sledování inzerce a delece.
Kvantifikace a analýza transkriptů mRNA
Běžnou aplikací qPCR je analýza genové exprese, např.g., porovnání koncentrací mRNA zájmového genu mezi kontrolními a ošetřenými vzorky. Kvantifikaci mRNA lze provést pomocí dvoukrokového nebo jednostupňového procesu RT-qPCR (viz Reverzní transkripce kvantitativní PCR v reálném čase, kde najdete další podrobnosti o reakcích RT).
Dvoustupňová RT-qPCR
Reakce reverzní transkripce a qPCR se provádějí postupně v samostatných zkumavkách. Jako výchozí materiál se použije buď celková RNA, nebo méně
často poly(A)+ RNA, a cDNA se vytvoří elongačním postupem z oligo-dT primerů,
náhodných primerů, směsi oligo-dT primerů/náhodných primerů nebo genově specifických primerů za použití enzymu reverzní transkriptázy. Alikvotní část této reakce se pak přidá do qPCR.
Jednokroková RT-qPCR
Když se reakce reverzní transkripce a qPCR spojí do jedné zkumavky, zjednoduší se experimentální nastavení
a sníží se pravděpodobnost kontaminace, protože odpadá nutnost další manipulace se vzorkem.
Kvantifikace a analýza transkriptů ncRNA.
Většina nekódujících RNA je delší než 100 nukleotidů, a proto je lze detekovat a kvantifikovat pomocí RT-qPCR
stejnými technikami, které se používají pro analýzu mRNA. Naproti tomu krátké nekódující RNA, jako jsou mikro a piwi RNA, mají v podstatě délku jednoho primeru PCR. V důsledku toho je před provedením qPCR zapotřebí technika, která tyto krátké RNA prodlouží. V komerčně dostupných systémech se používají dva hlavní přístupy: 1) použití RT primeru s kmenovou smyčkou a 2) poly-A chvost a následná RT s oligo-dT adaptorovým primerem (obrázek 3.2). Alternativní přístup vyvinul Casoldi et al., který není komerčně dostupný, využívá ligování adaptační molekuly na veškerou RNA ve vzorku a specifický návrh primeru k rozlišení požadovaných cílů1,2.
Přístup RT primeru s kmenovou smyčkou vyvinula a komercializovala společnost Applied Biosystems (v současnosti Life Technologies/Thermo) pro následnou qPCR založenou na sondách TaqMan3. Jak je znázorněno na obrázku 3.2A, 5'-konec primeru RT se může párovat s bází s oblastí vzdálenou několik nukleotidů od jeho vlastního 3'-konce, čímž se vytvoří bázově spárovaný kmen oddělený nepárovou smyčkou. Všechny nukleotidy na 3'-konci primeru RT kromě několika posledních jsou univerzální, tj. obsahují stejnou sekvenci ve všech primerech miRNA. Několik posledních nukleotidů, které se táhnou 3' od kmene, je komplementárních k 3'-konci cílové miRNA. Prodloužením primeru podél templátu miRNA vznikne
cDNA, kterou lze amplifikovat pomocí přímého primeru specifického pro miRNA a univerzálního reverzního primeru, z nichž druhý je
komplementární k 5'-konci kmenové smyčky RT primeru.
Všechny ostatní komerční metody qPCR miRNA, včetně naší metody MystiCq® značky, používají k prodloužení miRNA poly-A chvost, jak popsali Shi a Chiang4. Poly(A) polymeráza (PAP), enzym nezávislý na šabloně, katalyzuje přenos adenosinových zbytků z ATP na 3'-konec jakékoli RNA. Jak je znázorněno na obrázku 3.2B, RT lze poté provést pomocí oligo-dT primeru. Oligo-dT primer obsahuje na svém 5'-konci adaptorovou sekvenci, která umožňuje následnou qPCR s dopředným primerem, který je komplementární ke specifické miRNA, a reverzním primerem, který je komplementární k adaptorové sekvenci.
Obrázek 3.2.Existují dvě komerčně dostupné metody pro RT a qPCR miRNA. A) K primárnímu kroku RT se po hybridizaci na 3' konec miRNA používá primer se smyčkou. Prodloužením PCR přes smyčku vznikne kombinovaná sekvence miRNA a univerzální sekvence, která je dostatečně dlouhá pro amplifikaci B) Přidání poly A chvostu k miRNA poskytuje primingové místo pro primer, který se skládá z oligo-dT traktu a univerzální primingové sekvence. Výzkum nukleových kyselin podle Oxford University Press. Reprodukováno se souhlasem Oxford University Press ve formátu pro opakované použití v knize/e-knize prostřednictvím Copyright Clearance Center.
Oba komerční přístupy mají své výhody i nevýhody. Stem-loop priming umožňuje dvoukrokovou RT-qPCR, zatímco většina metod s poly-A chvosty vyžaduje další krok pro RT před qPCR. Existují produkty, které kombinují poly-A tailing a RT v jediné reakci pro 2-krokovou PAP tailing/RT-qPCR. Při tomto přístupu však může být detekce méně citlivá (nepublikované interní výsledky). Naopak, poly-A tailing následovaný RT vytváří stabilní pool cDNA, který lze použít k detekci jakékoli mikroRNA, mRNA nebo jiné RNA, a to okamžitě nebo kdykoli v budoucnu. V případě metody stem-loop/TaqMan je pro detekci každé miRNA zapotřebí jiný primer. Do jedné reakce RT lze přidat více primerů s kmenovou smyčkou5 a pro provedení multiplexní RT lze od společnosti Life Technologies zakoupit pooly primerů RT pro více miRNA. Ani jedna z těchto možností však neumožňuje qPCR detekci miRNA objevených později, ani neumožňuje qPCR detekci mRNA ze stejné cDNA. Systém popsaný Castoldim et al1,2 je jedinečný v tom, že poskytuje prostředky pro detekci mRNA, prekurzorů a plně zpracovaných molekul miRNA ze stejného vzorku celkové RNA.
požadavky na qPCR
Přístroje
Mnoho přístrojů qPCR bylo navrženo tak, aby podporovaly určitý rozsah aplikací, např.g., porovnejte schopnosti vysoce výkonného přístroje ABi 7900 využívajícího automatické vkládání 384jamkových destiček s přístrojem Eco vyráběným a prodávaným společností Illumina, který podporuje jednu 48jamkovou destičku. Nejvhodnější přístroj tedy odpovídá potřebám výzkumu. Je žádoucí vybrat přístroj s uživatelsky přívětivým softwarem, který vykonává nejžádanější funkce a má flexibilitu z hlediska výstupu dat, aby s nimi bylo možné snadno manipulovat v navazujících softwarových balících pro statistickou analýzu. Tím se zkrátí doba potřebná k zaškolení personálu, a tedy i k zahájení generování výsledků. Mezi další požadované vlastnosti patří blok PCR, který je absolutně uniformní (absolutní maximální odchylka 1 Cq = 2násobek v 96 jamkách replikace), a optický systém, který excituje a detekuje emisi co nejcitlivěji a nejrovnoměrněji v širokém rozsahu vlnových délek. To umožňuje široký výběr fluoroforů a multiplexování. Dalšími prvky, které je třeba zvážit, jsou provozní náklady spojené se specifickým spotřebním materiálem, např, pokud se pro reakce nepoužívá standardní mikrotitrační destička, a také pohodlí při nakládání destiček/zkumavek nestandardního formátu.
Šablona
K zahájení qPCR je zapotřebí velmi málo kopií cílové nukleové kyseliny (odpovídá přibližně 100 pg gDNA nebo cDNA). Aby se minimalizovala kontaminace inhibitory reakce, mělo by být počáteční množství templátu omezeno na minimum potřebné k dosažení přesné kvantifikace. Pokud je výchozím materiálem RNA, návrh primerů a ošetření DNázou I sníží signály, které mohou být generovány kontaminací gDNA.
Primery
Ať už používáte barvivo vázající dsDNA nebo detekční chemii založenou na sondě, je návrh kvalitních primerů jedním z nejdůležitějších předexperimentálních kroků při qPCR. Podrobné pojednání o návrhu testu najdete PCR, qPCR, dPCR Assay Design. Pro maximalizaci citlivosti a specifičnosti by měly být zahrnuty všechny požadované modifikace, například uzamčená nukleová kyselina (qPCR Detection Chemistry).
Sonda (sondy)
Při použití sond jako mechanismu detekce amplikonů nejsou detekovány dimery primerů a nespecifické produkty, ale je třeba se jim vyhnout, protože mohou snížit účinnost reakce. Pro maximalizaci citlivosti a specifičnosti by měl být vybrán vhodný typ sondy pro danou aplikaci a měly by být zahrnuty všechny požadované modifikace, jako je například uzamčená nukleová kyselina (qPCR Detection Chemistry).
dNTPs
Standardní master směsi pro PCR a qPCR obsahují dATP, dCTP, dGTP a dTTP. K dispozici jsou však některé směsi, které nahrazují dTTP dUTP. Produkty z předchozích reakcí provedených s dUTP budou obsahovat uracil místo thyminu. Ty jsou pak náchylné ke štěpení pomocí uracil-DNA-glykosylázy (UNG). Předchozí inkubace následných reakcí s UNG proto zabraňuje kontaminaci přenosem mezi reakcemi. Aby byly všechny PCR v laboratoři účinné, musí používat dUTP.
Horčík
Chlorid hořečnatý (MgCl2) je nezbytný pro aktivitu reverzní transkriptázy, Taq DNA polymerázy a Taq DNA 5' až 3' exonukleázy. Optimální koncentrace Mg2+ pro reakce obsahující DLP se obvykle pohybují mezi 3-6 mM. Většina master mixů obsahuje MgCl2, někdy je však nutné optimalizovat koncentraci, takže je třeba přidat další zkumavku čistého MgCl2 je obvykle součástí produktu master mix (viz Optimalizace a validace testu). V některých případech může být požadována reakční směs, která neobsahuje MgCl2 aby bylo možné použít nízkou koncentraci, např, při použití detekční sondy Scorpions® Probe.
Reverzní transkriptáza
Pro úspěch RT-qPCR je rozhodující enzym reverzní transkriptáza, který poskytuje vysoké výtěžky cDNA a zároveň si zachovává aktivitu při vysoké teplotě. Výkon při vysokých teplotách pomáhá zajistit, aby oblasti RNA s významnou sekundární strukturou byly destabilizovány a přístupné pro hybridizaci a následnou amplifikaci. Při provádění jednostupňové RTqPCR umožňuje vysokoteplotní výkonnost použití genově specifických primerů s vysokou teplotou tání (Tm), což zvyšuje specifičnost reakce. Při provádění dvoukrokových protokolů je důležité zajistit, aby enzym vedl k lineárnímu a proporcionálnímu výtěžku cDNA z RNA (viz Reverzní transkripce pro podrobnosti o hodnocení RT).
Taq DNA polymeráza
Stejně jako při výběru nejvhodnější reverzní transkriptázy pro RT je zásadní výběr vhodného enzymu polymerázy. Zásadním problémem přírodní Taq DNA polymerázy je, že enzym má zbytkovou aktivitu při nízké teplotě. Nespecifická vazba primerů vede v důsledku této zbytkové aktivity polymerázy k tvorbě nespecifických produktů. Tuto situaci pomáhají napravit protilátkami blokované nebo chemicky blokované Taq DNA polymerázy ("horký start"), které zabraňují aktivitě enzymu až do zahájení denaturačního kroku při vysoké teplotě.
Pufr
Pufry nebo hlavní reakční směsi obvykle obsahují dNTP, Taq DNA polymerázu, MgCl2 a stabilizátory. V závislosti na požadavcích na detekční chemii, přístroj a reakci může být také obsaženo barvivo SYBR Green I, ROX™, fluorescein a inertní nakládací barviva (Loading Control Dyes). Složky PCR pufru a stabilizátory jsou obvykle patentované výrobcem. Pokud jsou zakoupeny samostatně, je možná maximální flexibilita, protože každou složku lze v reakci optimalizovat individuálně. Naproti tomu však nákup složek dohromady jako master mix sice snižuje flexibilitu, ale zvyšuje konzistenci a pohodlí šarže a zároveň snižuje počet pipetovacích kroků, a tím i pravděpodobnost chyby a kontaminace.
Kontrolní načítací barviva
Některé termální cyklery PCR v reálném čase vyžadují, aby bylo do každé reakce zahrnuto načítací barvivo, například ROX, které kontroluje variabilitu optického systému a normalizuje rozdíly v intenzitě signálu. Podobně některé termální cyklery vyžadují počáteční fluoresceinový signál k vytvoření virtuálního pozadí při práci s testy s barvivem SYBR Green I (které má velmi nízké pozadí). Ty mohou být dodávány v master mixu nebo jako samostatné složky, aby bylo možné použít vhodnou koncentraci.
Pokyny MIQE
Jedním z jasných problémů při použití qPCR je, že je velmi snadné získat čísla, která lze pak snadno interpretovat jako kvantitativní výsledky. To však může být stejně zavádějící, protože k rozlišení potenciálních artefaktů způsobených nevhodným návrhem, provedením nebo analýzou dat může být nutná kontrola kvality a další analýza. Zveřejnění zdánlivě významných údajů bez odpovídající kontroly kvality vedlo ke zprávám, které v lepším případě nejsou biologicky nebo klinicky relevantní a v horším případě jsou nepřesné.
Každý krok experimentálního procesu qPCR, od získání vzorku po analýzu dat qPCR, je náchylný k variabilitě6. Variabilita se proto může vyskytnout při výběru a zpracování vzorků, extrakci nukleových kyselin (může vést k rozdílům v kvalitě, které způsobují nedostatečnou reprodukovatelnost detekce cílových hodnot qPCR), návrhu a optimalizaci testu (přispívá k rozdílům v účinnosti a citlivosti testu) a analýze dat (vyžaduje určitou subjektivní interpretaci a použití vhodných statistických metod). Je velmi důležité, aby informace poskytované vědeckému publiku obsahovaly dostatečné informace pro kritické posouzení experimentu7, přesto je zřejmé, že tomu tak vždy není8. Pokyny "Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments" (MIQE)9 se těmito obavami zabývají. Cílem pokynů MIQE je zvýšit transparentnost stanovením minimálních informací o analýze, které jsou nutné k tomu, aby čtenář mohl posoudit technickou platnost publikace, a poskytnout vodítko pro návrh, optimalizaci a validaci nových qPCR analýz.
MIQE se skládá z devíti oddílů (návrh experimentu, vzorek, nukleové kyseliny, reverzní transkripce, cíl, primery a sondy, podrobnosti o analýze, cyklování PCR a analýza dat; navštivte naši stránku MIQE a stáhněte si kontrolní seznam, tabulka 1). Všechny parametry se týkají informací, které by měly být získány během procesu návrhu, optimalizace a validace experimentu. Při použití komerčních testů nebo testů z publikované literatury by měla být ještě provedena optimalizace a validace. Dokument MIQE obsahuje kontrolní seznam s faktory označenými jako nezbytné, které jsou považovány za nezbytné pro adekvátní popis qPCR testu, zatímco ostatní složky jsou označeny jako žádoucí, což znamená, že tyto informace jsou užitečné, ale i bez nich lze test replikovat a údaje v rámci publikace vyhodnotit. Je důležité si uvědomit, že uvádění účinnosti PCR, analytické citlivosti a specifičnosti každého jednotlivého testu je zásadní a mělo by být určeno zkoušejícím za použití podmínek v laboratoři. Při provádění digitální PCR existují specifická hlediska (viz Digital PCR), která byla řešena v nedávné publikaci Digital PCR MIQE10.
Jste v souladu s MIQE?
Minimální informace pro zveřejnění kvantitativních experimentů PCR v reálném čase
aKlinická chemie Copyright 2009 by American Association For Clinical Chemistry, Inc. Reprodukováno se souhlasem American Association For Clinical Chemistry, Inc. ve formátu Internet posting via Copyright Clearance center.
bVšechny podstatné informace musí být předloženy spolu s rukopisem, Žádoucí informace by měly být předloženy, pokud jsou k dispozici. Pokud jsou primery z RTPrimerDB, informace o cíli qPCR, oligonukleotidech, protokolech a validaci jsou dostupné z tohoto zdroje.
cPři první extrakci RNA je nezbytné posoudit nepřítomnost DNA pomocí testu bez zpětné transkripce. Jakmile je vzorek validován jako vzorek bez DNA, je zařazení kontroly bez reverzní transkripce žádoucí, ale již ne nezbytné.
dZveřejnění sekvence sondy je velmi žádoucí a důrazně se doporučuje. Protože však tuto informaci poskytují všichni, nikoliv komerční prodejci předpřipravených testů, nemůže to být zásadní požadavek. Používání takových testů se nedoporučuje.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?