Řešení problémů s amplifikací PCR a RT-PCR

Mnoho běžných problémů s PCR a RT-PCR se zjistí během elektroforézy reakčních produktů v agarózovém gelu. Patří mezi ně nepřítomnost očekávaného amplifikačního produktu, přítomnost nespecifických produktů, nadměrné rozmazání a přítomnost pásu "primer dimer". Níže je uveden přehled možných příčin a řešení těchto problémů.

Tabulka 7.4. Možné příčiny a řešení problémů s amplifikací PCR a RT-PCR.

Problém	Možná příčina	Řešení
Na gelu nejsou pásy	Termální cyklér nefungoval správně	Pokud nebyla připravena pozitivní kontrola, zvažte testování činidel v kontrolní reakci s templátem a primery, u kterých bylo dříve prokázáno, že fungují správně.
	Bylo přidáno nedostatečné množství templátu nebo příliš mnoho templátu	Změřte množství templátu potřebné pro váš systém.
	Pro DNA: Kvalita šablony byla špatná nebo obsahovala inhibitory	Nečistá DNA může selhat při správné amplifikaci. Použijte čerstvě připravenou DNA nebo izolujte templát jinou metodou.
	Koncentrace primerů byla příliš nízká nebo byla nevyvážená	Ujistěte se, že koncentrace primerů je v doporučeném rozmezí a že koncentrace obou primerů PCR je stejná.
	Byly zavedeny nukleázy	Připravte nový templát. Ujistěte se, že dodržujete bezpečnostní opatření proti vnesení nukleáz. To je obzvláště důležité, pokud je výchozím materiálem RNA.
	Pro RNA: Templát je v pufru obsahujícím EDTA	EDTA přítomná v roztoku RNA chelatuje Mg2+ potřebný pro RT-PCR a může vést k neoptimálním výsledkům. Pro kompenzaci přidejte další Mg2+ při sestavování reakcí. Podrobnosti naleznete v návodu k výrobku.
	Reagencie nebyly před použitím řádně rozmraženy	Před sestavením reakcí všechny reagencie rozmrazte a důkladně promíchejte.
	Teplota žíhání primerů byla příliš vysoká	Snižujte teplotu žíhání v krocích po 2 °C.
	Teplota denaturace nebyla optimální	Zkuste zvýšit teplotu nebo dobu trvání počátečního denaturačního kroku. To je užitečné zejména u šablon bohatých na GC.
	Doba extenze byla příliš krátká	Zvýšit dobu extenze. To může být důležité zejména u dlouhých PCR.
	Termický cyklér neměl správnou teplotu	Opravte/kalibrujte termický cyklér nebo použijte jiný přístroj.
Mimořádné, nespecifické pásy na gelu	Primery hybridizovaly k sekundárnímu místu na šabloně	Navrhněte nové primery, které jsou méně specifické pro sekundární místo. Zvyšte teplotu žíhání v krocích po 2 °C až 5 °C.
	Došlo ke kontaminaci DNA v primerech nebo pufrech	Provedete negativní kontrolní reakci (bez templátu). Pokud je zjištěna kontaminace, připravte čerstvé materiály.
	Pro RNA: Templát je kontaminován DNA	Provedete krok s DNázou a zcela inaktivujete/odstraníte DNázu. Případně připravte RNA jinou metodou.
	Bylo přidáno příliš mnoho šablony	Změřte množství šablony pro váš systém.
	Koncentrace primerů byla příliš vysoká	Změňte množství primerů pro váš systém.
	Termální cyklér neměl správnou teplotu	Opravte/kalibrujte termální cyklér nebo použijte jiné zařízení.
Nadměrné rozmazání amplifikované DNA&.nbsp;	Bylo přidáno příliš mnoho šablony	Změňte množství šablony pro váš systém.
	Bylo provedeno příliš mnoho cyklů	Snižte počet cyklů pod 35.	Snižte počet cyklů.
	Podmínky tepelného cyklování nebyly pro váš termocykler optimální	Optimalizujte podmínky na základě doporučení výrobce.
	Teplota žíhání byla příliš nízká	Při použití Ready-To-Go Beads může být nutná opětovná optimalizace teploty žíhání. Zvyšte teplotu žíhání v krocích po 2 °C až 5 °C.
	Koncentrace primerů byla příliš vysoká	Změňte množství primerů pro váš systém.
	Doba prodlužování byla příliš dlouhá	Zkracujte dobu prodlužování po malých krocích.
	Pro DNA: Kvalita šablony byla nízká	Nečistá DNA se nemusí správně amplifikovat. Použijte čerstvě připravenou DNA nebo izolujte templát jinou metodou.
	Na gel bylo vloženo příliš mnoho DNA	Zopakujte amplifikaci s menším množstvím vzorku.
Viditelné dimery primerů	Bylo přidáno příliš mnoho primerů/příliš vysoká koncentrace primerů	Změřte množství primerů pro váš systém.
	Primery mají komplementární překrývající se sekvenci	Navrhněte primery tak, aby nedocházelo k samokomplementárním vnitřním sekvencím. Zvyšte teplotu žíhání. Použijte produkty PCR illustra™ Hot Start Mix.