Kvantifikace oligonukleotidů

Co je to kvantifikace oligonukleotidů?

Kvantifikace oligonukleotidů je proces stanovení koncentrace oligonukleotidů - krátkých, jednořetězcových nebo dvouřetězcových polymerů nukleových kyselin (DNA nebo RNA) - v roztoku. Toto měření je nezbytné pro různé aplikace v molekulární biologii, biotechnologii a klinické diagnostice.

Využití kvantifikace oligonukleotidů

• Přesné experimentální nastavení: Přesná kvantifikace zajišťuje, že se při experimentech, jako je PCR, qPCR, sekvenování a hybridizační testy, použije správné množství oligonukleotidů. Tato přesnost je zásadní pro reprodukovatelnost a spolehlivost výsledků.
• Kontrola kvality: Kvantifikace pomáhá při posuzování čistoty a integrity oligonukleotidů. Jakákoli kontaminace nebo degradace může ovlivnit výsledky experimentů, proto je pravidelná kvantifikace nezbytná pro udržení standardů kvality.
• Standardizace koncentrací: V klinických a diagnostických aplikacích jsou standardizované koncentrace oligonukleotidů nezbytné pro zajištění konzistentního výkonu napříč testy a laboratořemi.
• Optimalizace reakcí: Znalost přesné koncentrace oligonukleotidů umožňuje výzkumným pracovníkům optimalizovat podmínky jejich reakcí, což zajišťuje účinnost a efektivitu v procesech, jako je syntéza genů, interference RNA a editace genů CRISPR-Cas9.

Obvyklá úskalí a tipy pro přesnou a spolehlivou kvantifikaci oligonukleotidů

• Vhodně zřeďte vzorky:
• Vysoce koncentrované roztoky oligonukleotidů nařeďte tak, aby spadaly do lineárního rozsahu kvantifikační metody (např. UV spektrofotometrie), aby nedošlo k nasycení a zajistily se přesné hodnoty.
• Zohledněte čistotu a kontaminanty: K posouzení čistoty oligonukleotidu změřte poměr absorbance (A260/A280). Poměr ~1,8 pro DNA a ~2,0 pro RNA ukazuje na čisté vzorky, zatímco odchylky mohou naznačovat kontaminaci proteiny nebo jinými nečistotami.
• Používejte správný extinkční koeficient: Při výpočtu koncentrace na základě absorbance při 260 nm se ujistěte, že je použit správný extinkční koeficient. Tento koeficient závisí na konkrétní sekvenci a složení oligonukleotidu.
• Vyhněte se kontaminaci: Používejte vodu bez nukleáz a čisté skleněné nádobí, abyste zabránili kontaminaci, která by mohla ovlivnit přesnost kvantifikace. Kontaminanty, jako jsou soli a organické sloučeniny, mohou rušit odečty absorbance.
• Správně skladujte oligonukleotidy: Skladujte roztoky oligonukleotidů při doporučených teplotách (obvykle -20 °C nebo -80 °C) a vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování a rozmrazování, které mohou vést k degradaci a nepřesné kvantifikaci.
• Zvažte použití metod založených na fluorescenci: U vzorků s nízkou koncentrací zvažte použití kvantifikačních metod založených na fluorescenci, které jsou citlivější než UV absorbance a mohou detekovat nižší koncentrace oligonukleotidů.

Jak kvantifikovat oligonukleotidy

Koncentraci nukleových kyselin v roztoku lze snadno kvantifikovat ve spektrofotometru po vystavení ultrafialovému (UV) světlu při vlnové délce 260 nm (obrázek 1). Tato technika funguje, protože báze mají konjugované dvojné vazby, které UV světlo absorbují různě.

Obrázek 1. Absorbance ve spektrofotometru. Nukleová kyselina v roztoku ve vzorkovací komoře je osvětlena dopadajícím UV světlem o maximální intenzitě 260 nm. Protože báze nukleové kyseliny absorbují část UV světla, intenzita prošlého UV světla se sníží. Absorbance se stanoví podle následujícího vzorce:

Kde: A₂₆₀ = absorbance při 260 nm; I_o = intenzita dopadajícího světla; a, I = intenzita procházejícího světla.

Po odečtení absorbance vstupuje do hry Beerův-Lambertův zákon, který vztahuje velikost absorbance ke koncentraci absorbující nukleové kyseliny takto:

Kde:

A₂₆₀ = absorbance při 260 nm

��₂₆₀ = extinkční koeficient oligonukleotidu při 260 nm v L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

c    = koncentrace v mol L^-1

ℓ    = délka cesty v cm

Klíčem k Beerovu-Lambertovu zákonu je extinkční koeficient, který měří, jak silně absorbující báze snižují intenzitu UV záření od dopadu k průchodu. Vzhledem k tomu, že absorbance každé báze je jiná, složení bází, pořadí bází a délka sekvence ovlivní konečnou absorbanci konkrétní kvantifikované nukleové kyseliny. Proto se největší přesnosti dosáhne, když se pro každý oligonukleotid vypočítá extinkční koeficient. Model nejbližších sousedů je pro oligonukleotidy ideální a vzorec je následující:

Tabulky 1 a 2 zobrazují extinkční koeficienty nejbližších sousedů a jednotlivých bází, které se použijí ve vzorci nejbližších sousedů při výpočtu konečného celkového extinkčního koeficientu oligonukleotidu.

Tabulka 1. Extinkční koeficienty nejbližších sousedů v L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1 Vzorec pro nejbližšího souseda považuje báze ve výrazu nejbližšího souseda za dinukleotidy, takže extinkční koeficienty jsou určeny pro páry čtením z pozice 5' na 3'. Například pro tetranukleotid 5'-ACGT-3' existují tři dinukleotidy (AC, CG a GT). Extinkční koeficienty pro tyto dvojice jsou 21 200, 18 000 a 20 000 L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1, v tomto pořadí.

	3' pozice
5' pozice	Báze	A	C	G	T
	A	27,400	21,200	25,000	22,800
	C	21,200	14,600	18,000	15,200
	G	25,200	17,600	21,600	20,000
	T	23,400	16,200	19,000	16,800

Tabulka 2. Extinkční koeficienty jednotlivých bází v L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1 Vzorec pro nejbližší sousedy zachází s bázemi ve výrazu pro jednotlivé báze individuálně, takže extinkční koeficienty jsou pro každou bázi jeden.

Základní
A	C	G	T
15,400	7,400	11,500	8,700

Vzhledem k tomu, že délka dráhy vzorkovací komory je 1,0 cm, jsou nyní zohledněny všechny vstupy Beerova-Lambertova zákona, a proto lze rovnici přeuspořádat tak, aby bylo možné vypočítat koncentraci daného oligonukleotidu.

Pro výpočet koncentrace se Beerův-Lambertův zákon přeuspořádá takto:

Příklad: Výpočet pro 5'-ACGT-3'

Krok první: vypočtěte extinkční koeficient

��₂₆₀ = (AC+CG+GT)-(C+G) L ⋅ mol^-1. ⋅ cm^-1

��₂₆₀ = (21 200+18 000+20 000)-(7 400+11 500) L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

��₂₆₀ = 40,300 L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

Ve všech technických online zobrazeních a tiskové dokumentaci by se výše uvedená hodnota 40,300 zobrazovala jako 40.3. Je to proto, že jednotky jsou L ⋅ mmol^-1 ⋅ cm^-1  (milimol místo mol).

Druhý krok: výpočet koncentrace

A₂₆₀ se nastaví na jednotku optické hustoty (OD) 1,0

.

Třetí krok: výpočet molární hmotnosti (MM)

Obvykle se místo termínu "molární hmotnost" používá termín "molekulová hmotnost", ale vzhledem k tomu, že pro tyto výpočty jsou zapotřebí jednotky molární hmotnosti, je nejsprávnější termín "molární hmotnost". Pro zjednodušení zobrazení byly také výše uvedené molární hmotnosti jednotlivých základů zaokrouhleny na nejbližší celé číslo. Proto je vypočtená hodnota 1 170 o něco nižší než skutečná hodnota 1 173,83.

Čtvrtý krok: Převod koncentrace na obvyklé jednotky

Pro tuto konkrétní sekvenci tedy platí: V případě této sekvence je tedy: 5'-ACGT-3', 1 OD = 29,0 µg ml^-1  (jeden OD je množství oligonukleotidu v 1 ml roztoku, které vykazuje A₂₆₀ 1.0 při délce světelné cesty 1,0 cm). Pro srovnání uvádíme hodnotu stanovenou pomocí OligoEvaluator™, našeho online kalkulátoru sekvencí oligonukleotidů:

Mezi ručně vypočtenou hodnotou 29,0 a hodnotou 29,1 vypočtenou nástrojem OligoEvaluator je výborná shoda (rozdíl je způsoben tím, že při ručním výpočtu byly použity zaokrouhlené molární hmotnosti jednotlivých bází, jak je vysvětleno výše ve třetím kroku).

Podle programu OligoEvaluator je 29,1 hodnota, která by byla zobrazena v technickém listu dodaném s tímto oligonukleotidem.

Zkrácený výpočet pro 5'-ACGT-3'

Výše uvedené kroky dlouhého výpočtu jsou zdlouhavé. Následující vzorec spojuje všechny kroky do jednoho, a proto jej lze použít jako zkratku:

 

Modifikace

Jediný rozdíl mezi výpočtem koncentrace standardního a modifikovaného oligonukleotidu spočívá v tom, že se bere v úvahu molární hmotnost modifikace a přičítá se k celkové molární hmotnosti oligonukleotidu. Například pokud naše výše uvedená sekvence:

●     5'-ACGT-3'

se změní na

●     5'-6-FAM™-ACGT-3'

a, nová molární hmotnost je 1,711.3 g mol^-1 dosadí buď do dlouhých výpočtů, nebo do zkráceného vzorce, je nová koncentrace

Tato hodnota se dobře shoduje s hodnotou určenou nástrojem OligoEvaluator:

Rychlé převody

Při experimentech byly zpravidla ověřeny následující rychlé převody (ds = double stranded; ss = single stranded):

●     A₂₆₀ dsDNA = 50 µg ml^-1
●     A₂₆₀ ssDNA = 37 µg ml^-1
●       ●nbsp;A₂₆₀ ssRNA = 40 µg ml^-1

Bez provádění jakýchkoli výpočtů poskytují tyto konverzní faktory rozumné odhady pro delší sekvence s rovnoměrnějším rozložením bází A, C, G a T, jako jsou sekvence vzniklé střihem genomové DNA (pro odhad dsDNA). U oligonukleotidů je však složení bází pravděpodobněji zkreslené, a proto jsou tyto odhady nespolehlivé (často nadhodnocují koncentraci). Koncentrace se musí určit pro každý oligonukleotid, jak je uvedeno výše, buď pomocí dlouhého, nebo zkráceného výpočtu. K ověření kvantifikačních hodnot uvedených v technických listech lze použít buď dlouhý, nebo zkrácený výpočet.