Optimalizace a validace testu PCR

Technický průvodce technologiemi PCR

Na této stránce

• Optimalizace podmínek PCR
  
• Ověření návrhu primerů
• Optimalizace koncentrace sondy
• Optimalizace reakceOptimalizace složek reakce a multiplexní testy
• Optimalizace koncentrace Mg2+ 
• Výběr fluoroforu sondy a zhášeče
• Pokyny pro optimalizaci kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR)
• Vyhodnocení testu

Optimalizace podmínek PCR

Optimalizace a validace testů jsou nezbytné i při použití předem navržených a komerčně získaných testů. Optimalizace je nutná, aby bylo zajištěno, že test je tak citlivý, jak je požadováno, a že je specifický pro cíl, který vás zajímá. Například detekce patogenů nebo profilování exprese vzácných mRNA vyžaduje vysokou citlivost; detekce SNP vyžaduje vysokou specifičnost a kvantifikace virů potřebuje jak vysokou specifičnost, tak citlivost. Testy vyžadující vysokou specifičnost jsou obzvláště zranitelné, pokud jsou prováděny bez optimalizace a odpovídajících kontrol. Stejně tak v případě, že má být v multiplexních reakcích detekováno více cílů současně, musí být podmínky testu optimalizovány tak, aby byly všechny cíle detekovány stejně. Validace poskytuje údaje potřebné k odůvodnění dalšího používání testu v dalších výzkumných projektech

1.

Existuje řada faktorů, které lze změnit, aby se dosáhlo optimálního výkonu testu a tím vyšší molekulární citlivosti, specifičnosti a přesnosti. Testy zakoupené od kvalifikovaných komerčních dodavatelů stále vyžadují validaci v laboratoři, ve které se používají. Tvrzení týkající se výkonnosti testů by měla být ověřena v podmínkách studie, včetně testovaných vzorků, specifických činidel a zvoleného přístroje.

K testům, které byly navrženy tak, že byla splněna všechna žádoucí kritéria návrhu (PCR/qPCR/dPCR Assay Design) je pravděpodobné, že bude dobře fungovat v široké škále podmínek. Všechny testy však mají soubor optimálních podmínek a ty závisí na přístroji, vybraných činidlech (podmínkách pufru), koncentraci primerů a/nebo teplotě žíhání (T_a), koncentraci hořčíku a dokonce i rychlosti náběhu. Protože je obvyklé provádět analýzu na vybraném přístroji a za standardních podmínek pufru, většina optimalizačních postupů se zaměřuje na úpravu kinetiky vazby primeru pomocí koncentrace primeru nebo teploty žíhání (T_a)/teploty tání (T_m).

Nezávisle na tom, zda je cílem DNA (qPCR) nebo RNA (RT-qPCR), pomohou následující předběžné kroky zajistit úspěšnou kvantifikaci:

• Ověření návrhu primerů
  
• Optimalizace koncentrací primerů
  
• Optimalizace teploty žíhání primerů
• Optimalizace koncentrace sondy
  
• Optimalizace reakčních složek a podmínek multiplexu
  
• li>Ověření výkonu pomocí standardní křivky a analýzy křivky tání

Validace návrhu primerů

Validace návrhu primerů je zvláště důležitá při přebírání primerů z předchozí publikace nebo při použití komerčně dodávaného testu. Návrh primerů lze přezkoumat s ohledem na pokyny k návrhu testu uvedené v PCR/qPCR/dPCR Assay Design. Je velmi důležité zajistit, aby:

• Primery byly homologní s požadovanou cílovou sekvencí.
  
• Primery pro reverzní komplement jsou správné. Pečlivě zkontrolujte pořadí bází reverzního komplementu (pomocí http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).
  
• Jsou detekovány vhodné sestřihové varianty.
  
• Jsou vyloučeny SNP, pokud to není pro test nutné.
  
• Oligos a amplikon nepřijímají sekundární strukturu.
  
• Mají nízký potenciál vzájemné hybridizace oligos reakce.

Primerový dimer

Schopnost primerů vzájemně hybridizovat, zejména na 3'-konci, může vést k prodloužení primeru během PCR a vzniku produktů nezávislých na cíli, tzv. primerových dimerů. Kdykoli se vytvoří a amplifikují produkty dimerů primerů, odvádějí složky reakce od syntézy požadovaného produktu, čímž snižují účinnost a citlivost testu. Dimery primerů jsou proto problémem v reakcích využívajících detekci založenou na sondách i na barvivu SYBR Green I. U detekce založené na barvivu, jako je SYBR Green I, ovlivňují dimery primerů také specifičnost testu, protože nespecifické barvivo vázající DNA se váže na primery a je detekováno spolu s požadovaným produktem. Proto je třeba se vyhnout primerům, u kterých je pravděpodobné, že budou tvořit dimery.

Primer dimer prediction

Chcete-li určit potenciál pro tvorbu dimerů primerů, použijte software pro návrh primerů k analýze tvorby duplexů.Program  OligoArchitect poskytuje podrobné informace o síle hybridizace self-dimerů a cross-dimerů (obrázek 9.1). Jakékoli 3'-koncové dimery vytvořené buď hybridizací primeru se sebou samým, nebo se svým partnerem, musí být velmi slabé (ΔG ≥ -2,0 kcal, obrázek 9.1).

Jak lze snížit dimery primerů?

Jakýkoli primer s terminálním ΔG < -2,0 kcal i s prodlužujícím se 3'-koncem (5'-overlap) by se měl vyvarovat. Nejsilnější celkový dimer by měl být nestabilní (ΔG ≥ -6,0 kcal). Chcete-li se vyhnout silným 3'-koncovým dimerům a zároveň zachovat specifičnost, zvolte primery, které mají 2 G nebo C zbytky v posledních 5 bázích, 1 G nebo C v posledních 3 bázích a A nebo T na 3'-konci (obrázek 9.1).

Obrázek 9.1. Analýza primerů z hlediska potenciálu primer-dimerů. Sekvence primerů byly analyzovány pomocí návrhového softwaru OligoArchitect s cílem určit jejich schopnost vytvářet duplexy. U nejlepší varianty primerů je uveden potenciál pro vlastní dimery a křížové dimery. Multiplexní qPCR poskytne nejlepší výsledky, pokud mají všechny primery v reakci podobné teploty tání (rozdíl Tm ≤ 2 °C) a netvoří silné 3'-duplexy (ΔG ≥ -2,0 kcal).

Optimalizace koncentrace primerů a teploty žíhání (T_a)

Při optimalizaci podmínek testu pomocí koncentrace primerů se zvolí pevná T_a  (obvykle 60 °C) a optimální podmínky pro každý primer se řeší samostatně. To je rozhodující při navrhování testu, který má být prováděn v multiplexu, protože všechny reakce musí probíhat při stejné teplotě žíhání, a je to taktika, kterou lze také použít k záchraně špatně fungujících testů, pro které není k dispozici alternativní návrh. Technicky jednodušším přístupem je zvolit pevnou koncentraci primerů a poté optimalizovat T_a výběr nejlepšího výsledku pro tyto primery v kombinaci. Tento přístup se upřednostňuje při použití několika testů a detekce barviva vážícího dsDNA, jako je SYBR^® Green I. Tento přístup však vyžaduje přístroj, který může současně spustit reakční programy využívající různé možnosti T_a .

Optimalizace koncentrace primerů

Při použití qPCR založené na sondě se často dosahuje uspokojivých výsledků při použití konečné koncentrace obou primerů 500 nM a sondy 250 nM, zejména pokud je cíl PCR hojný a není vyžadována maximální citlivost. Poněkud nižší koncentrace primerů, mezi 200 nM a 400 nM, jsou obvykle lepší při použití detekce založené na barvivu SYBR Green I, aby se minimalizovala nespecifická amplifikace, a při optimalizaci multiplexních reakcí. Chcete-li ověřit, zda jsou standardní podmínky vhodné pro použití, proveďte analýzu standardní křivky (viz Assay Evaluation). Pokud je detekce lineární, reprodukovatelná a gradient se pohybuje mezi -3,2 a -3,5 v rozsahu cílových koncentrací očekávaných ve vzorcích, nemusí být nutné dále optimalizovat koncentrace primerů a sond.

Některé z indicií, že test není dobře optimalizován, jsou; že postrádá reprodukovatelnost mezi replikáty a je obecně neúčinný a necitlivý. Výkonnost testu se obvykle testuje při různých koncentracích primerů, například od 50-800 nM, s použitím každého primeru v každé koncentraci (obrázek 9.2; úplný protokol viz Příloha A, Protokoly; Optimalizace primerů).

Obrázek 9.2. Příklad optimalizace primeru. Uspořádání proužků s 8 zkumavkami (nahoře a vlevo) a PCR desky pro ředění a dávkování primerů.

Vybere se kombinace koncentrací, která dává nejnižší C_q, nejnižší odchylku v opakováních a záporné NTC (obrázek 9.3)².

Obrázek 9.3. Výsledky optimalizace koncentrace PCR primerů z testu s barvivem SYBR Green I. A) Zavedené pokyny doporučují testovat různé koncentrace dopředných (F) a reverzních (R) primerů. V tomto příkladu byly testovány kombinace 50 nM až 600 nM, aby se určila optimální koncentrace pro test. V tomto experimentu je obrovský rozdíl v Cq způsobený různými koncentracemi primerů, což ilustruje, jak to může ovlivnit konečné údaje (údaje od Jense Stolteho, EMBL). B) Tento experiment ukazuje optimalizaci dobře navrženého testu a variabilitu způsobenou koncentrací primeru. Kombinace 400 nM dopředného a reverzního primeru byla zvolena jako optimální, protože tato kombinace představovala nejnižší koncentrace primeru, které reprodukovatelně poskytly nejčasnější hodnoty Cq při zachování sigmoidální křivky.

Jestliže je jeden cíl v multiplexní reakci výrazně hojnější než ostatní cíle nebo pokud jeden pár primerů poskytuje mnohem nižší C_q než ostatní cíle, může amplifikace tohoto cíle v reakci dominovat a spotřebovat složky reakce dříve, než jsou ostatní cíle detekovatelné. Úprava koncentrací primerů může umožnit vyváženější amplifikaci všech cílů. Chcete-li zjistit, zda budou takové úpravy přínosné, připravte standardní křivky (viz Assay Evaluation), které pokrývají rozsah očekávaných cílů pro každý pár primerů samostatně (singleplex) a se všemi primery dohromady (multiplex). Pokud reakce multiplex a singleplex poskytují podobné výsledky, jsou koncentrace primerů vhodné. Na druhou stranu optimalizace koncentrací primerů pravděpodobně zlepší výsledky, pokud je citlivost v multiplexních reakcích nepřijatelná. Snižte koncentrace primerů u těch párů primerů, které vedou k nízkým hodnotám C_q a/nebo zvyšte koncentrace u těch, které poskytují vysoké hodnoty C_q v rozmezí 50-500 nM.

Optimalizace teploty žíhání primerů

Kvantitativní testy PCR se obvykle provádějí pomocí dvou- nebo tříkrokových programů teplotního cyklování, obvykle s 35-40 cykly. Dvoukrokové reakce cyklicky probíhají mezi dvěma teplotami, obvykle 95 °C (obvykle po dobu 10-15 s) a 60 °C (obvykle po dobu 30-60 s nebo 5-10 s za rychlých podmínek). Dvoukrokové teplotní reakce se volí při provádění testů s dvojznačnou sondou (TaqMan nebo hydrolýza), protože nižší teplota prodlužování podporuje exonukleázovou aktivitu DNA polymerázy a brání vytěsnění sondy. Toto by byl upřednostňovaný protokol cyklických podmínek pro provádění mnoha různých testů za stejných parametrů. Nevýhodou použití dvoukrokové metody však je, že omezuje potenciální možnosti návrhu primerů a omezuje optimalizaci testu pouze na koncentraci primerů, protože není možná optimalizace teploty žíhání (T_a).

Tříkrokový protokol cyklování je vhodnější v případě, že cílové sekvence jsou složité a buď je obtížné optimalizovat zvolené primery, nebo použitý detekční systém není závislý na použití hydrolyzující sondy. Tříkrokové strategie cyklují mezi: 95 °C (obvykle po dobu 10 s), teplotou žíhání (mezi 55 °C a 65 °C, obvykle po dobu 10-20 s nebo 5 s za rychlých podmínek) a 72 °C (obvykle po dobu 20-30 s nebo 15-20 s za rychlých podmínek). V tomto případě lze T_a optimalizovat pro další zlepšení výkonu testu pomocí následujícího protokolu:

• Začněte na dolním konci testovaného rozsahu T_a který je určen T_a primerů, a postupně zvyšujte teplotu v postupných krocích (obvykle se testuje mezi 55 °C a 65 °C). Některé přístroje mají gradientní bloky, které usnadňují optimalizaci teploty v jednom běhu.
  
• Testujte každý reakční produkt na specifičnost, a to buď analýzou křivky tání post-PCR, nebo elektroforézou v agarózovém gelu, jak je popsáno níže.
  
• Optimální teplota žíhání je ta, která vede k nejnižšímu C_q, negativnímu NTC, analýze křivky tání odhalující detekci specifického produktu a vysoké reprodukovatelnosti mezi opakovanými reakcemi.

Je-li teplota žíhání příliš nízká, reakce bude nespecifická. Pokud je však teplota příliš vysoká, může strmost ovlivnit účinnost reakce, což má za následek nedostatečnou amplifikaci nebo velmi vysoké hodnoty C_q velmi nízké výtěžky a nízkou reprodukovatelnost.

Příklad optimalizace teploty je uveden na obrázku 9.4. V tomto případě (obrázek 9.4A) byly identické reakce provedeny na gradientovém bloku PCR tak, že teplota žíhání byla v rozmezí 47,8 °C až 71,7 °C. Žíhání při teplotách 64,8 °C a 61,7 °C vede k identickým hodnotám C_q ale o něco nižší teplota poskytuje vyšší výtěžek produktu, o čemž svědčí vyšší fluorescence v koncovém bodě a reakce se zjevně vyšší účinností (naznačeno gradientem amplifikačního grafu). Absolutní stanovení účinnosti vyžaduje posouzení standardní křivky (viz Assay Evaluation) nebo použití algoritmů pro stanovení účinnosti v jedné zkumavce^3,4. Druhá část obrázku (obrázek 9.4B) ukazuje srovnání chování primerů za stejných reakčních podmínek, ale v různých reagenčních směsích. Zde je zřejmé, že složení pufru ovlivňuje reprodukovatelnost testu a rozsah teplot, při kterých je dosaženo stabilních dat. Nakonec byly navrženy dva nezávislé testy na stejný cílový gen a ty byly optimalizovány v každém pufru. Jak ukazuje obrázek 9.4C, každý pufr vyžadoval jinou optimální teplotu, aby bylo možné získat srovnatelné údaje o C_q z obou párů primerů (61,7 °C u LuminoCt a 58,4 °C u KiCqStart).

Obrázek 9.4. Optimalizace primerů pomocí Ta. A) Pro identické reakce byl testován rozsah teplot žíhání. Žíhání při 64,8 °C a 61,7 °C vedlo ke stejným hodnotám Cq a vysoké reprodukovatelnosti mezi replikáty, ale o něco nižší teplota vedla k vyššímu výtěžku produktu. B) Dvě identické reakce byly nastaveny v různých směsích činidel (LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™nebo KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™) a byl proveden teplotní gradient primerů. Optimální teplota se v každé směsi lišila a při běhu reakcí v činidlech KiCqStart byly rozdíly mezi daty menší. C) Dva páry primerů ke stejnému cíli (KS a navržené pomocí Beacon Designer, BD) byly spuštěny v různých reakčních směsích. Je vidět, že optimální teplota žíhání se v různých činidlech liší (61,7 °C v činidle LuminoCt a 58,4 °C v činidle KiCqStart), aby bylo možné získat podobné výsledky z primerů.

Ačkoli většina komerčních testů je dodávána se standardními podmínkami PCR testu, jednotlivé testy mohou mít prospěch z další optimalizace, aby se určily podmínky, které jsou specifické pro konkrétní kombinaci primerů. Důvodem mohou být dimery primerů, nespecifická amplifikace nebo neoptimální účinnost reakce za zvolených standardních podmínek. Po dokončení optimalizace by měla být účinnost testu vypočtena použitím zvolených podmínek na měření série standardů a přípravou standardní křivky (Assay Evaluation). Je možné, že i po optimalizaci může být účinnost stále suboptimální a v nejhorším případě může být nutná nová zkouška.

Rozsah tolerovaných hodnot účinnosti by měl uživatel definovat před zahájením procesu optimalizace. V ideálním případě by účinnost měla být >95 %. Je však možné provádět přesná měření s testy, které mají účinnost <90 %, a stejně jako u návrhu primerů může sekvence cíle diktovat, že cíl nelze amplifikovat s vyšší účinností. Nicméně při použití testu s nižší účinností bude pravděpodobně ovlivněna přesnost a mez detekce. Za těchto okolností je nutné při interpretaci a vykazování údajů postupovat s náležitou opatrností¹.

Optimalizace koncentrace sondy

Pro většinu testů lze použít konečnou koncentraci sondy 250 nM. Pokud však není požadována maximální citlivost, mohou stačit nižší koncentrace sondy, čímž se sníží náklady na test. Chcete-li optimalizovat podmínky pro sondu, vyzkoušejte ji v několika koncentracích, od 50 do 500 nM konečné koncentrace, v kombinaci s optimalizovanými koncentracemi primerů a nejnižší koncentrací cílové nukleové kyseliny, která má být zahrnuta do konečných pokusů. Lze použít nejnižší koncentraci sondy, která umožňuje nejcitlivější detekci (C_q ≤ 30 s nejlepší reprodukovatelností).

Optimalizace složek reakce a multiplexních testů

Existují testy, které jsou obzvláště citlivé na podmínky pufru/reakce. U těchto testů může další úprava reakčních pufrů optimalizací koncentrace MgCl₂ , přidáním zesilovačů PCR (Mueller in PCR Technologies; Current Innovations, 2013⁵) nebo úpravou rychlosti náběhu přístroje vést ke zlepšení výkonu. Kromě pokynů pro optimalizaci testů uvedených v předchozích částech jsou tyto faktory důležité zejména při optimalizaci multiplexních reakcí.

Optimalizace koncentrace Mg²⁺ 

Hořčík hraje v PCR několik rolí. Je to nezbytný dvojmocný kationtový protiiont pro dNTP a kofaktor pro všechny polymerázy. Dvojmocné kationty silně ovlivňují dvouvláknovou hybridizaci DNA. Zvyšující se koncentrace hořčíku zvyšuje stabilitu nebo teplotu tání duplexu DNA. Z toho vyplývá, že vysoké hladiny hořčíku zvyšují afinitu primerů k hybridizaci, včetně chybných primitivních událostí a interakcí primer-primer. Nesprávně primitivní duplexy DNA se stávají substráty pro DNA polymerázu, což vede k vytváření vedlejších produktů a snižuje účinnost PCR. Proto má koncentrace MgCl₂ vliv na specifičnost i výtěžnost PCR, protože hořčík ovlivňuje hybridizaci primeru k cíli, procesivitu Taq DNA polymerázy a také rychlost hydrolýzy exonukleázovou částí, pokud se používá pro štěpení sondy v qPCR. Nedostatečné množství MgCl₂ má tedy za následek nízké výtěžky v důsledku nízké rychlosti polymerace DNA polymerázy, zhoršené vazby primeru a neúčinného štěpení sondy. Pokud je koncentrace MgCl₂ příliš vysoká, specifičnost reakce bude ohrožena, protože to povede k větší stabilitě nespecifické hybridizace primerů.

Na rozdíl od běžných testů PCR, které používají standardní koncentrace MgCl₂ 1,5-2 mM, vyžadují testy qPCR s hydrolýzní sondou vyšší koncentrace, přibližně 3-5 mM, aby bylo dosaženo účinného štěpení sondy. Přítomnost MgCl₂ také zvyšuje rychlost hybridizace DNA, což umožňuje účinnou hybridizaci během rychlých cyklických podmínek používaných mnoha přístroji. Optimalizace koncentrace MgCl₂ nabývá na významu při provádění multiplexních reakcí.

Soli, jako je KCl nebo (NH₄)₂SO_4,. také změní duplex DNA T_m, ale účinek je u těchto monovalentních kationtů méně drastický.

Obrázek 9.5. Účinky koncentrace hořčíku.

Účinky zobrazené na obrázku 9.5 se při provádění multiplexní PCR ještě zvětší. Současné provádění více reakcí zavádí konkurenci o činidla a zhoršuje jakékoli neoptimální podmínky, což vytváří významné změny v účinnosti PCR.

Ramp Rates

Vzácné případy, kdy obtížná reakce vyžaduje další úpravy. Když byly vyčerpány všechny ostatní možnosti, může být možné obnovit ztracenou situaci empirickým testováním a úpravou rychlosti náběhu PCR.

Výběr fluoroforu a zhášeče sondy

Při provádění multiplexních testů je také důležité maximalizovat spektrální oddělení vícenásobných emisí z různých fluoroforů, aby se usnadnila izolace signálu a analýza dat. Proto jsou pro multiplexní aplikace užitečné fluorofory s úzkou, dobře rozlišitelnou šířkou pásma, které jsou široce oddělené. Ve skutečnosti je však výběr fluoroforu omezen optickým systémem přístroje. Kvantitativní metody detekce PCR a digitální PCR obsahuje další informace týkající se výběru fluoroforů a zhášečů.

Pokyny pro optimalizaci kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR)

Při provádění RT-qPCR je nejen důležité vzít v úvahu pokyny pro standardní qPCR, jak bylo uvedeno dříve, a optimalizovat RT, jak je uvedeno v části Reverzní transkripce, ale také se zabývat následujícími body, které jsou specifické pro krok RT:

• Ověřte kvalitu RNA (čištění vzorku a posouzení kvality).
  
• Ujistěte se, že primery pokrývají nebo lemují dlouhé introny (PCR/qPCR/dPCR Assay Design).
  
• Optimalizace reverzní transkripce (Reverse Transcription).
  
• Ověřte kontrolní data bez reverzní transkriptázy (No-RT).

Ujistěte se, že primery pokrývají nebo lemují dlouhé introny

Ačkoli je většina gDNA ze vzorku odstraněna během čištění RNA, žádný postup neodstraňuje veškerou DNA. Protože PCR je schopna amplifikovat jedinou molekulu DNA, je při použití RT-qPCR kontaminující DNA amplifikována stejně jako RNA. Pokud je cílová mRNA poměrně hojná (stovky nebo tisíce kopií na buňku), bude výsledný signál z amplifikace kontaminující DNA zanedbatelný ve srovnání s produkty z RNA; pokud je však cílová mRNA středně hojná nebo vzácná (100 kopií na buňku), může signál vznikající z amplifikace DNA vést k chybně vysokým odhadům hladin mRNA. Abyste se vyhnuli amplifikaci DNA během RT-qPCR, používejte pokud možno primery, které buď obklopují intron, který se v sekvenci mRNA nevyskytuje, nebo které překlenují exon-exonový spoj (PCR/qPCR/dPCR Assay Design).

Pokud gen zájmu neobsahuje introny, pokud není známa pozice intronů nebo pokud neexistují vhodné primery, které by pokrývaly introny nebo je obklopovaly, může být nutné natrávit vstupní RNA pomocí DNázy I bez RNázy nebo amplifikační třídy. Údaje z kontrol bez reverzní transkriptázy lze použít k určení, zda je nebo není nutné další štěpení pomocí DNázy I.

Ověření údajů z kontrol bez reverzní transkriptázy (No-RT)

Bez ohledu na to, zda primery pokrývají nebo lemují introny, by měla být specifita testů RT-qPCR testována v kontrolních reakcích, které neobsahují reverzní transkriptázu (kontrola bez reverzní transkriptázy), aby se vyhodnotila potenciální amplifikace z kontaminující DNA. Jak je popsáno v PCR/qPCR/dPCR Assay Design, sekvence DNA s krátkými introny (≤1 kb) mohou být při RT-PCR úspěšně amplifikovány. Mnoho genů má další kopie nebo pseudogeny, které postrádají jeden nebo více intronů. V důsledku toho by měl být příspěvek DNA k výsledným údajům z testů RT-PCR testován provedením reakce, která obsahuje vzorek RNA, ale neobsahuje enzym RT, spolu s reakcemi obsahujícími RNA i enzym RT (obrázek 9.6). Amplifikace DNA se v qPCR považuje za přijatelnou, pokud jsou hodnoty C_q pro reakce bez RT alespoň o 5 cyklů vyšší než pro reakce s RT6. Pokud je však mezi hodnotami C_q pro reakce s RT a bez RT méně než 5 cyklů, může amplifikace DNA přispět ke kvantifikaci mRNA.

Obrázek 9.6. Hodnocení kontrol bez RT. Produkty RT-PCR vytvořené v přítomnosti (+) nebo nepřítomnosti (-) enzymu RT byly frakcionovány na 2% agarózovém gelu v TBE barveném ethidium bromidem. Primery pro cílovou mRNA v A lemují 1 kb intron. Cílová mRNA v B se shoduje s několika geny, z nichž alespoň jeden je pseudogen, který postrádá intron mezi primery použitými pro RT-PCR, a proto dává produkt stejné velikosti s enzymem RT i bez něj.

Pokud kontaminace RNA DNA přispívá k významnému signálu experimentu, měla by být RNA před RT-qPCR natrávena pomocí DNázy I bez RNázy nebo amplifikační třídy, aby bylo možné spolehlivě kvantifikovat mRNA. Všimněte si, že štěpení DNázou na koloně (postup nabízený s mnoha komerčně dostupnými sadami pro čištění RNA, při kterém se štěpení DNázou provádí, zatímco je RNA vázána na křemíkovou kolonu) je méně účinné při odstraňování DNA než štěpení v roztoku po eluci RNA z kolony. V důsledku toho nemusí být štěpení DNázou na koloně (OC) pro RT-qPCR dostatečné (obrázek 9.7). Kontroly bez RT by měly být provedeny s RNA natrávenou DNázou, aby se ověřilo, že rozklad byl úspěšný a dostatečný. V příkladu uvedeném na obrázku 9.7 postačuje k spolehlivé detekci cílové mRNA štěpení OC DNázou. Pokud by byla požadována větší citlivost, nestačila by ke spolehlivé kvantifikaci mnohem méně početné mRNA.

Všimněte si, že různé typy buněk a tkání, stejně jako různé podmínky růstu, produkují výrazně odlišné koncentrace specifických mRNA. Kromě toho různé metody purifikace RNA poskytují různá množství kontaminující DNA. V důsledku toho by se reakce s reverzní transkripcí a bez ní měly provádět alespoň jednou s každým novým výchozím materiálem, metodou přípravy RNA nebo testem.

Obrázek 9.7. Srovnání digesce DNázy na koloně (OC) s digescí DNázy po přípravě. Celková RNA byla připravena z 30 mg kousků myších jater buď pomocí naší sady GenElute™ Total RNA Kit, nebo postupem purifikace na koloně od alternativního dodavatele, obojí podle pokynů výrobce. Dva vzorky RNA byly připraveny s DNázovým produktem na koloně příslušného výrobce a dva byly připraveny bez DNázového štěpení. Po přečištění byly alikvoty čtyř vzorků RNA připravených bez DNázy na koloně natráveny naší DNázou Amplification Grade DNase I podle pokynů výrobce. Stejné podíly všech byly použity v jednostupňové RT-qPCR. Jsou zobrazeny grafy fluorescence pro dva ze vzorků RNA. S produkty obou výrobců bylo dosaženo podobných výsledků a pouze postup vyžadující ošetření DNAse po purifikaci odstranil veškerou gDNA.

Vyhodnocení testu

Po optimalizaci testu a určení nejcitlivějších podmínek je důležité určit specifičnost, účinnost a technický dynamický rozsah testu.

Stanovení specifičnosti pomocí analýzy křivky tání

Specifičnost lze stanovit pomocí analýzy křivky tání. Provedení křivky tání vyžaduje začlenění reportérového barviva, jako je barvivo SYBR Green I, nebo použití nehydrolyzující sondy, jako je Molecular Beacon nebo Scorpions^®. sondy (viz Metody kvantitativní PCR a digitální PCR detekce). Po vytvoření amplikonu během qPCR se amplikon inkubuje při zvyšujících se teplotách, obvykle v rozmezí 55 °C až 95 °C. Uživatel by si však měl ověřit, že teoretický bod tání jeho amplikonu spadá do tohoto rozmezí, protože bude záviset na velikosti a obsahu GC. Experimentální T_m se bude mírně lišit mezi různými běhy a činidly, především kvůli rozdílům v koncentraci MgCl₂ a dalších iontů.

Změna fluorescence se stanoví a vynese do grafu jako rychlost změny fluorescence v závislosti na teplotě. Vzhledem k tomu, že SYBR Green I je nespecifické barvivo, které se váže na jakoukoli dvouřetězcovou DNA, je při použití této detekční chemie důležité ověřit, že qPCR produkuje pouze požadovaný produkt. K určení počtu a přibližné velikosti produktů lze použít analýzu křivky tání nebo disociační křivky. Výsledkem testu s vysokou specifitou bude jediný pík tání při vysoké teplotě v reakcích obsahujících pouze cíl, přičemž v kontrolách bez šablony nebude detekováno nic nebo jen velmi málo (obrázek 9.8A). Pokud má křivka tání více než jeden hlavní pík, jako na obrázcích 9.8B a 9.8C, lze identitu produktů dále zkoumat jejich rozlišením na agarózovém gelu barveném ethidium bromidem. Jak ukazují obrázky 9.8D a 9.8E, reakce B a C obsahují nadměrné množství primer-dimerů nebo jiných nespecifických produktů. Snížení koncentrace primerů často sníží množství nespecifických produktů. Pokud jsou nespecifické produkty stále detekovány ve významném množství při nízkých hladinách primerů, je nejlepší primery znovu navrhnout.

Obrázek 9.8. Vyhodnocení křivek tání. Křivky tání nebo disociační křivky ukazující ostrý pík specifického produktu při teplotě > 80 °C s velmi malým množstvím nespecifického produktu při nižších teplotách (A) nebo značným množstvím nespecifického produktu při nižším tání (B a C). D až F ukazují produkty PCR, jak je znázorněno na křivkách tání A až C, rozdělené na 2% agarosových gelech barvených ethidium bromidem.

Příklad analýzy křivky tání odhalující kontaminaci RNA primery gDNA a NTC je uveden na obrázku 9.9. Na obrázku 9.9A je z testovacích reakcí patrný specifický produkt a v NTC je přítomen menší produkt tající při nižší teplotě. To svědčí o tvorbě primer-dimerů v nepřítomnosti templátu. To je běžné a je to znepokojující pouze tehdy, když jsou tyto primer-dimerové produkty patrné ve zkušebních vzorcích, jak je uvedeno na obrázku 9.8. Příklad na obrázku 9.9B ukazuje detekci nezpracovaného genu gDNA ve vzorku DNA pomocí stejného testu (v tomto případě byly primery umístěny v exonech zahrnujících intron), který byl použit také pro detekci mRNA. Produkty jsou rozlišeny podle profilu tání, přičemž produkt gDNA taje při vyšší teplotě, protože obsahuje také intron.

Obrázek 9.9. Příklad analýzy křivky tání A) dimery primerů v kontrole bez templátu a B) amplifikace přes intron gDNA.

Specifičnost je při navrhování testů pro genotypování velmi důležitá. Často se jedná o testy se sondou a vyžadují rozlišení rozdílu jedné báze, například při rozlišování jednonukleotidových polymorfismů (SNP). V tomto případě je rozhodující testovat každou sondu v jedné reakci proti templátu, o kterém je známo, že obsahuje specifickou shodnou sekvenci, a proti neshodné sekvenci.

Stanovení účinnosti a meze detekce

Nejúčinnějším způsobem měření účinnosti testu je konstrukce standardní křivky ze sériového ředění templátu. Účinnost testu lze měřit jako faktor gradientu standardní křivky. Provádí se široký rozsah koncentrací vzorku, čímž se zajistí, že tyto koncentrace dosáhnou limitního ředění, což umožní stanovit technický dynamický rozsah testu ze stejného experimentu.

Pro tato technická stanovení účinnosti testu je vhodný jakýkoli vhodný templátový materiál. Výběr standardního, přenosného referenčního materiálu umožňuje mezilaboratorní a vnitrolaboratorní validaci. Proto lze tuto fázi validace provést na linearizovaném nebo niklovaném plazmidu (superzavinutá DNA neamplifikuje efektivně a vede k nízké reprodukovatelnosti), klonovaném fragmentu nebo syntetickém oligu. Je však třeba si uvědomit, že validace na těchto cílech je měřítkem funkce testu a nezohledňuje variabilitu vnesenou složitostí biologického vzorku.

Stanovení technického dynamického rozsahu a účinnosti testu ze standardní křivky je znázorněno na obrázku 9.10. V tomto příkladu byl templát naředěn desetinásobnou sérií 11 log, a tak je teoretický detekční limit demonstrován jako 3 kopie (nejnižší C_q), ačkoli přesnost tohoto měření je jasně dána reprodukovatelností, která je při tak vysokých cyklech relativně nízká.

Obrázek 9.10. Příklad vysoké reprodukovatelnosti a širokého rozsahu detekce pomocí sériového ředění linearizovaného plazmidu. Pro každé ředění bylo provedeno osm opakování a amplifikace cíle byla detekována pomocí barviva SYBR Green I. Kvantifikace je možná v rozmezí 3×1010 až 3 kopie.

Účinnost testu se určuje měřením gradientu standardní křivky, která je grafem logaritmu cílové koncentrace v závislosti na C_q (obrázek 9.10). Test se 100% účinností by vykazoval zdvojnásobení v každém cyklu (E=2) a gradient -3,323.

    Účinnost lze vypočítat podle rovnice:

     Účinnost = 10^(-1/sklon) -1. Poznámka: software mnoha přístrojů poskytuje míru účinnosti jako
    procento. Tato hodnota je procentuální podíl E=2; účinnost 95 % se tedy rovná E=1,9

     Sklon = m a určuje se ze standardní křivky rovnice y=mx+C.

     C je teoretická intercepce na ose y a poskytuje relativní míru citlivosti testu.

Sklony mezi -3,1 a -3,6 vedou k účinnosti mezi 90 % a 110 % a jsou obvykle akceptovány, ale je důležité usilovat o co nejblíže 100 %, jak to test umožňuje. Údaje uvedené na obrázku 9.11 ilustrují normální rozsah kolísání účinnosti a citlivosti řady různých testů. To slouží jako důkaz, jak důležité je tyto údaje uvádět v publikacích^1,6-8.

Obrázek 9.11. Příklad stanovení účinnosti a porovnání několika potenciálních referenčních genů. Jak je vidět, mají velmi rozdílnou účinnost a citlivost (údaje poskytli studenti, kteří se zúčastnili semináře Advanced qPCR, EMBL).

Byly navrženy alternativní přístupy k výpočtu účinnosti standardní křivky. Tyto metody uvádějí účinnost jednotlivých reakcí ve zkumavce. Tyto přístupy se spoléhají na algoritmy pro modelování křivek amplifikačních dějů, a jsou tak závislé na počtu cyklů, během nichž dochází k nárůstu fluorescence. Tyto metody jsou nejpravděpodobnější, pokud se měření provádí pomocí barviva vázajícího DNA nebo sond Scorpions^® Probes, protože tyto testy poskytují větší změnu fluorescence na cyklus. Ačkoli tento typ přístupu potenciálně nabízí ideální alternativu ke standardním křivkám, druhá jmenovaná metoda je stále běžnější metodou používanou pro vyhodnocování testů. Je tomu tak proto, že standardní křivky poskytují nejen odhad účinnosti, ale také další informace o pracovním dynamickém rozsahu, citlivosti a reprodukovatelnosti a jsou koncepčně jednodušší na použití

Hodnota R² neboli to, jak dobře data odpovídají přímce standardní křivky, je mírou reprodukovatelnosti a je ovlivněna přesností pipetování a dynamickým rozsahem testu. Proto je při hodnocení testů rozhodující použít pro každé ředění minimálně tři technické replikáty. Pokud je R² ≤0,985, nemusí test poskytovat spolehlivé výsledky, protože reprodukovatelnost mezi opakováními je nízká. Pokud je jeden nebo více bodů při nejnižších hladinách vstupní nukleové kyseliny posunut mimo lineární oblast grafu, je pravděpodobné, že naměřená koncentrace překračuje citlivost testu. Pokud je jeden nebo více bodů při nejvyšším počtu kopií vstupní nukleové kyseliny posunut od lineární oblasti grafu, je pravděpodobné, že reakce je nasycená a že koncentrace cíle přesahuje užitečný rozsah testu. Případně pokud je několik náhodných bodů nad nebo pod přímkou, může být problém v přesnosti pipetování nebo v optimalizaci testu. Zkontrolujte, zda špičky správně zapadají do pipety a zda je dávkovaný objem reprodukovatelný, a ověřte optimalizaci primerů, jak je popsáno výše.

Standardní křivka je základním nástrojem pro validaci multiplexních reakcí. Současné provádění více reakcí zavádí konkurenci o činidla a zhoršuje jakékoli neoptimální podmínky, což vytváří významné změny v účinnosti PCR. Obrázek 9.12 demonstruje tento bod. Křivky účinnosti pro dva cíle primer/sonda byly provedeny jednotlivě a poté v multiplexu. Z grafu je patrné, že zatímco jednotlivé reakce (tmavě modrá a zelená čára) poskytují relativně podobnou účinnost a citlivost (hodnoty na ose y), společné provedení reakcí dramaticky mění citlivost a účinnost multiplexní reakce.

Obrázek 9.12. Reakce v jednom komplexu vs. reakce v duplexu.

Odkazy

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, et al. 2009. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 55(4):611-622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

2. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006. SPUD: A quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytical Biochemistry. 351(2):308-310. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.01.051

3. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters. 339(1):62-66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4

4. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WMH, Karlen Y, Bakker O, van den Hoff MJB, Moorman AFM. 2009. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. 37(6):e45-e45. https://doi.org/10.1093/nar/gkp045

5. Nolan T, Bustin SA. 2013. PCR Technology: Current Innovations. 3. CRC Press.

6. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1(3):1559-1582. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236

7. Bustin SA. 2010. Why the need for qPCR publication guidelines??The case for MIQE. Methods. 50(4):217-226. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006

8. Huggett J, Bustin SA. 2011. Standardisation and reporting for nucleic acid quantification. Accred Qual Assur. 16(8-9):399-405. https://doi.org/10.1007/s00769-011-0769-y

9. Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, et al. 2013. Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods. 59(1):32-46. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.08.011