Syntéza oligonukleotidů DNA
Fosforamiditová chemie, vyvinutá v 80. letech 20. století a později vylepšená o nosiče na pevné fázi a automatizaci, je metodou volby pro výrobu oligonukleotidů DNA. Na rozdíl od biosyntézy probíhá chemická syntéza ve směru 3' → 5' podle kroků uvedených na obrázku 1. Poznámka: tento článek se zaměřuje výhradně na syntézu DNA (ačkoli je podobná, existují rozdíly oproti chemické syntéze RNA).
Přečtěte si více informací o
Obrázek 1.Shrnutí cyklu syntézy oligonukleotidů na pevné fázi. V kroku 1, detritylaci, se z prvního nukleosidu vázaného na pevný nosič odstraní ochranná skupina 5'-DMT. V kroku 2, Coupling, volný 5'-OH prvního nukleosidu vázaného na pevnou podložku napadá fosfor vstupujícího druhého nukleosidu a vytěsňuje jeho diisopropylaminoskupinu. V kroku 3, Oxidace, se nestabilní fosfitový triester přemění na stabilní fosfátový triester, což umožní v dalším cyklu přejít ke kroku 1, Detritylace druhého nukleotidu. Před přechodem k dalšímu cyklu se však v kroku 4, Capping, acetylují nukleosidy s nezreagovaným 5'-OH na pevné podložce, čímž se zabrání prodlužování sekvencí s delečními mutacemi (Capping se provádí po Oxidation, aby se vytlačila veškerá voda, která by jinak inhibovala další cyklus reakce).
Fosforamiditová metoda syntézy oligonukleotidů
Tato část se zabývá podrobnou chemií každého ze čtyř kroků [krok 1 (detritylace), krok 2 (spojování), krok 3 (uzavírání) a krok 4 (oxidace)] ve fosforamiditové metodě.
Krok 1 (detritylace)
Cyklus je zahájen odstraněním 5'-DMT (4,4'-dimethoxytritylové) ochranné skupiny nukleosidu vázaného na pevný nosič (obsahuje koncovou 3' bázi oligonukleotidu). 5'-DMT zabraňuje polymerizaci nukleosidu během funkcionalizace pryskyřice s pevným nosičem. Mechanismus je zobrazen na obrázku 2.
Obrázek 2.Mechanismus detritylace. Ochranná skupina 5'-DMT se odstraňuje pomocí kyseliny trichloroctové (TCA) v rozpouštědle dichlormethanu (příliš koncentrovaný roztok TCA nebo příliš dlouhá doba detritylace vede k depurinaci, a tím snižuje celkový výtěžek konečného oligonukleotidu). Produkty zahrnují 3' terminální nukleosid s volným 5'-OH a DMT karbokation (rezonanční struktura vzniklá delokalizací elektronů není zobrazena). Nukleosid postupuje do kroku 2 syntézy, zatímco karbokacion DMT absorbuje při vlnové délce 495 nm a vytváří tak oranžovou barvu, kterou lze použít ke sledování účinnosti spojení.
Krok 2 (Spojení)
Po odstranění DMT může volný 5'-OH nukleosidu spojeného s pevným nosičem reagovat s dalším nukleosidem, který se přidává jako monomer fosforamiditu. Mechanismus je zobrazen na obrázku 3.
Obrázek 3.Spojovací mechanismus. Diisopropylaminoskupina vstupujícího monomeru fosforamiditu v rozpouštědle acetonitrilu je "aktivována" (protonována) kyselým katalyzátorem ETT [5-(ethylthio)-1H-tetrazol]. Míchání probíhá v kapalinových linkách syntézního přístroje, zatímco jsou činidla přiváděna na pevný nosič. Aktivovaný fosforamidit se dodává v mnohonásobném přebytku nad nukleosidem navázaným na pevný nosič, aby se reakce co nejvíce přiblížila dokončení. Produkty zahrnují dinukleosid s fosfitovou triesterovou vazbou a volnou diisopropylaminoskupinou.
Krok 3 (Oxidace)
Fosfitový triester vzniklý během spojovací reakce je nepřirozený a nestabilní, proto musí být před zahájením dalšího cyklu převeden na stabilnější druh fosforu. Oxidací se fosfitový triester přemění na stabilní fosfátový triester. Mechanismus je zobrazen na obrázku 4.
Obrázek 4.Mechanismus oxidace. Oxidace fosfitového triesteru se provádí jodem v přítomnosti vody a pyridinu. Produktem je fosfátový triester, což je v podstatě standardní páteř DNA s β-kyanoethylovou ochrannou skupinou na volném kyslíku.
Krok 4 (Capping)
Protože 100% účinnost spojení není možná, vždy existují nukleosidy spojené s pevným nosičem s nezreagovaným 5'-OH. Pokud nebudou tyto hydroxylové skupiny blokovány, budou reagovat během dalšího cyklu, a tudíž povedou k chybějící bázi. Hromadění těchto delečních mutací v průběhu po sobě jdoucích cyklů by vytvořilo složitou směs "shortmerů", které se obtížně čistí, a proto by mohly učinit oligonukleotid nepoužitelným při následné aplikaci. Aby se zabránilo hromadění shortmerů, je nutné uzavírání. Mechanismus je zobrazen na obrázku 5.
Obrázek 5.Uzavírací mechanismus. Anhydrid kyseliny octové a N-methylimidazol reagují za vzniku meziproduktu v rozpouštědle tetrahydrofuranu, které obsahuje malé množství pyridinu. Míchání probíhá v kapalinových linkách syntézního přístroje, zatímco jsou činidla přiváděna na pevný nosič. Produktem je nukleosid navázaný na pevný nosič s acetylovaným 5'-OH (pyridin udržuje zásadité pH, čímž zabraňuje detritylaci monomeru fosforamiditu volným acetátem/kyselinou octovou).
Druhý cyklus
Druhý cyklus začíná krokem 1, detritylací, po níž následuje každý ze zbývajících tří kroků. Počet opakovaných cyklů se rovná požadovanému počtu bází. Syntetizujeme oligonukleotidy od 2 do 120 bází.
Štěpení
Náš patentovaný pevný nosič / linker je stabilní vůči všem fosforamiditovým činidlům, ale na konci syntézy je odštěpitelný od oligonukleotidu. Štěpení je nezbytné, aby se volný 3'-OH mohl účastnit biochemických reakcí, jako je například extenze DNA polymerázou při PCR, kdy oligonukleotid slouží jako primer. Reaktant a produkt jsou zobrazeny na obrázku 6.
Obrázek 6.Reaktant a produkt štěpení. Esterová hydrolýza linkeru (a současné odstranění pevného nosiče) se provádí působením koncentrovaného vodného amoniaku. Produktem je oligonukleotid s terminálním volným 3'-OH.
Deprotekce
Po štěpení se roztok oligonukleotidu v koncentrovaném vodném roztoku amoniaku zahřeje, aby se odstranily ochranné skupiny z bází a fosfátů.
Báze
Zatímco thymin ochrannou skupinu nevyžaduje, adenin, cytosin a guanin ano, protože obsahují exocyklické primární aminoskupiny. Ochranné skupiny musí být odstraněny, aby mohly vzniknout správné vodíkové vazby mezi oligonukleotidem a cílovou nukleovou kyselinou. Reaktant a produkt jsou zobrazeny na obrázku 7.
Obrázek 7. Reaktant a produkt deprotekce bází. Oligonukleotid v koncentrovaném vodném roztoku amoniaku se zahřeje. Mezi ochranné skupiny patří: Produktem reakce jsou plně deproteinované báze A, C a G. N(6)-benzoyl A, N(4)-benzoyl C a N(2)-isobutyryl G.
Kromě standardních ochranných skupin lze pro modifikované oligonukleotidy citlivé na amoniak použít labilní dimethylformamidyl G a "ultramild" ochranné skupiny. Tyto ochranné skupiny na příslušných bázích jsou zobrazeny na obrázku 8.
Obrázek 8.Labilní a ultramírné ochranné skupiny. Dimethylformamidylová ochranná skupina se obvykle odstraňuje v koncentrovaném vodném amoniaku zahříváním, ale za podstatně kratší dobu než isbutyrylová skupina. Mezi ultramírné ochranné skupiny patří: Obvykle se odstraňují při pokojové teplotě v koncentrovaném vodném roztoku amoniaku / methylaminu.
Tvorba fosfodiesteru
Pro přeměnu z fosfátového triesteru na fosfátový diester (fosfodiester) je třeba odstranit β-kyanoethylovou skupinu na volném kyslíku fosfátu. Mechanismus je zobrazen na obrázku 9.
Obrázek 9.Mechanismus tvorby fosfodiesterů prostřednictvím deprotece. Kyanoethylové skupiny se odstraňují v koncentrovaném vodném amoniaku β-eliminací. Reakce je rychlá, protože atomy vodíku na uhlíku sousedícím s kyano skupinou odvádějící elektrony jsou vysoce kyselé. Produktem je oligonukleotid s nativní fosfodiesterovou páteří a akrylonitril.
Důležité je mít na paměti, že účinnost spřažení není to jediné, co určuje výnos. Deprotekce, štěpení a čištění (dokonce i prosté odsolování) výtěžnost dále snižují. Naše garantované výtěžky založené na výrobním rozsahu a purifikaci najdete zde.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?