Řešení problémů se špatným růstem buněk
Růst buněk: Přehled
Zajištění přiměřeného růstu buněk je důležitou součástí sběru přesných dat s buněčnými kulturami. Buňky lze kultivovat v suspenzi nebo jako monovrstvu, která se připojí k kultivační nádobí, jako je baňka, miska nebo vícejamková destička. Způsob kultivace je určen endogenním fenotypem buněk a tkání původu - takže buňky získané z krve obvykle rostou v suspenzi, zatímco buňky získané z pevných tkání obvykle rostou v monovrstvách. Možné je také společné kultivování smíšené populace, která obsahuje jak připojené buňky, tak fenotypy v suspenzi.
Obrázek 1.Fáze růstu buněk
U buněk, které rostou jako monovrstva, je konfluence definována jako procento povrchu kultivační nádoby, které se při mikroskopickém pozorování jeví jako pokryté vrstvou buněk. Například 50% konfluence znamená, že polovina povrchu kultivační misky, baňky atd. je pokryta buňkami. U suspenzních buněk se pokrok v růstu obvykle měří podle doporučené hustoty buněk pro danou linii nebo typ - ale "splývání" lze hodnotit podle rostoucího zákalu a stabilní barvy média.
Růst buněk v kultuře obecně probíhá ve čtyřech fázích, které při grafickém vyjádření logaritmu počtu buněk v čase vytvářejí sigmoidální (esovitou) křivku, ačkoli doba strávená v každé fázi se u jednotlivých buněčných linií a kultur liší.
Lag fáze - Buňky se aklimatizují na kultivační podmínky a během této fáze se nedělí. K připojení buněk dochází zpravidla do 24 hodin po zahájení kultivace. Celková délka této fáze je určena růstovou fází a hustotou výsevu buněk, které byly použity k zahájení kultury.
Log (logaritmická) růstová fáze - Buňky se během této fáze aktivně dělí a je to nejlepší doba pro hodnocení růstu populace i pro celkový sběr dat. Na konci logaritmické fáze je nejlepší čas pro pasážování (subkultivaci) buněk, než může přeplnění vést ke stresu buněk.
Plateau (stacionární) fáze - Růst buněk v této fázi se zpomaluje, jak se buňky blíží 100% konfluenci, a méně než desetina buněk je v aktivním buněčném cyklu. Buňky jsou v této fázi nejnáchylnější k poškození; je proto třeba pečlivě sledovat, zda jsou buňky pasážovány před touto fází nebo na jejím začátku.
Fáze poklesu - Jako přirozená součást buněčného cyklu populace živých buněk klesá, protože v této fázi převažuje buněčná smrt.
Přesné počítání buněk má při hodnocení růstu buněk v kulturách zásadní význam, protože chybné počítání může vést k mylným závěrům o stavu buněk. Počet buněk lze stanovit pomocí hemocytometru. Nicméně, automatizované buněčné čítače využívající Coulterův princip, kdy buňky protékají jedna po druhé otvorem uvnitř elektrického senzoru, poskytují nejpřesnější počty buněk.
Obrázek 2.Scepter™ 3.0 Ruční automatizovaný počítač buněk.
Obvyklé příčiny a řešení špatného růstu buněk | |
|---|---|
| Problém/příčina | Řešení |
| Po rozmrazení ze zásoby nejsou žádné nebo jen málo životaschopné buňky | |
| Zásobní kultura byla nekvalitní | Ujistěte se, že výchozí kultura použitá k vytvoření zásoby byla řádně identifikována a je zdravá, bez mikrobiální kontaminace a v pozdní logaritmické fázi růstu (80-90 % konfluentní). Buňky sklízejte šetrně, aby nedošlo k jejich poškození. |
| Zásoba byla nesprávně zmrazena | Při zmrazování buněk v tekutém dusíku zajistěte, aby koncentrace buněk, media a další činidla - stejně jako protokol zmrazování - se řídí doporučeními dodavatele. Obecně platí, že zmrazování by mělo probíhat pomalu, přibližně při 1 až 3 °C za minutu, aby se minimalizovala tvorba ledových krystalů. K zajištění konzistentní a přiměřené rychlosti zmrazování použijte elektronickou programovatelnou nebo mechanickou mrazicí jednotku s funkcí zmrazování. Vyberte nejvhodnější kryoprotectant pro buňky. Pokud používáte glycerol, neskladujte jej na světle, protože působením světla se glycerol mění na cytotoxický akrolein. |
| Stav byl nesprávně skladován | Stav by měl být vždy udržován při teplotě nižší než -130 °C, ideálně v tekutém dusíku, aby byla zajištěna maximální životaschopnost. Skladování v parní fázi nad kapalným dusíkem je vhodnější než skladování v samotné kapalině kvůli riziku výbuchu lahvičky během rozmrazování, pokud by kapalný dusík unikl do kryovialky. |
| Sklad byl rozmrazen nesprávně | Při rozmrazování buněk postupujte podle protokolu doporučeného dodavatelem. Obecně platí, že buňky by měly být rozmrazovány rychle. Použijte předehřátá média. Odstraňte média obsahující kryoprotektant co nejdříve, abyste zabránili snížení životaschopnosti. Zajistěte, aby se s buňkami zacházelo opatrně. Nevířte ani neodstřeďujte při vysokých rychlostech, protože buňky jsou po kryokonzervaci obzvláště náchylné k poškození. |
| Slabé uchycení buněk po rozmrazení ze zásob nebo pasážování | |
| Hromadění statické elektřiny na plastových kultivačních nádobách (problematické zejména při nízké vlhkosti) | Zvýšení vlhkosti v místnosti. Otřete vnější stranu kultivačních nádob (dezinfikovanou) vlhkou utěrkou. Použijte antistatické zařízení. |
| Nedostatečné promíchání buněk, médií a/nebo jiných činidel | Zajistěte, aby byly roztok buněk a všechna činidla dostatečně promíchány. |
| Otáčení válečkových lahví je příliš rychlé | Otáčejte lahve pomaleji. |
| Pomalý růst buněk | |
| Buňky byly pasážovány příliš mnohokrát | Získejte novou zásobu buněk, která byla subkultivována méněkrát. |
| Buňky byly při sklizni příliš konfluentní | Začněte s novou zásobou buněk a skliďte ji ve fázi logaritmického růstu, před dosažením 100% konfluence. |
| Média, séra, pufry atd. jsou nekvalitní nebo nesprávně složené | Vyhoďte stávající reagencie a použijte nové šarže. |
| Hladiny CO2 neodpovídají tomu, co vyžaduje pufrovací systém na bázi hydrogenuhličitanů v používaných médiích, což vede k nedostatečné kontrole pH | Ujistěte se, že hladiny CO2 v inkubátoru odpovídají tomu, co vyžaduje pufrovací systém. Obecně platí, že čím vyšší je koncentrace hydrogenuhličitanu v pufru, tím vyšší je koncentrace CO2 potřebná ve směsi plynů v inkubátoru. |
| Mikrobiální (zejména mykoplazmová) kontaminace | Viz Problémy s kontaminací pro podrobné osvědčené postupy pro prevenci a eliminaci mikrobiální kontaminace. |
| Vystavení kultur fluorescenčnímu světlu způsobuje, že složky média citlivé na světlo (riboflavin, tryptofan a HEPES) se přeměňují na cytotoxické volné radikály a H2O2 | Uskladněte buňky a média ve tmě, mimo dosah fluorescenčního světla. |
| Nepřesná metoda počítání buněk vede k předpokládanému špatnému růstu buněk | Ujistěte se, že je počítaný vzorek dostatečně promíchán, aby se zabránilo lokálním odchylkám v hustotě buněk, které mohou ovlivnit přesnost počítání buněk. Překontrolujte všechny výpočty použité ke stanovení počtu pomocí manuální metody s hemacytometrem nebo zvažte automatizované počítání buněk. |
| Nerovnoměrný růst buněk | |
| .Nerovnoměrný růst buněk v nádobě indikuje nedostatečné promíchání buněk a/nebo média | Zajistěte, aby se směs buněk a všech činidel řádně promíchala jemným vířením nebo pipetováním, aby se zabránilo lokálním změnám koncentrace. |
| Nerovnoměrný růst buněk mezi pravděpodobně stejnými nádobami pěstovanými ve stejnou dobu může být způsoben kolísáním teploty v inkubátoru | Pokud je to možné, vyhněte se stohování kultivačních nádob na sebe, protože nádoby na dně jsou nejblíže kovovým policím a mohou se zahřívat nejrychleji. Pokud nádoby uložené v přední části inkubátoru vykazují menší růst než nádoby v zadní části, dbejte na to, aby dveře inkubátoru byly co nejvíce zavřené, a přemístěte nádoby směrem dozadu. |
| Specifické způsoby růstu: | |
| Nerovnoměrné odpařování v inkubátoru způsobuje snížení objemu média a špatný růst ve vnějších jamkách vícejamkové destičky | Udržujte plné zásobníky vody a zvlhčujte CO2 a další vstupující plyny. V případě potřeby vytvořte mapu "horkých míst" odpařování v inkubátoru, abyste se jim při dalších pokusech vyhnuli. |
| Vibrace inkubátoru způsobují soustředné kruhy (v miskách), rovnoběžné pruhy nebo nepravidelný vzor (v baňkách) | Umístěte inkubátory na stabilní povrchy, které nejsou sdíleny s jiným vybavením, v prostorách s nízkým provozem. Ostatní motorizovaná zařízení udržujte v co největší vzdálenosti. |
| Mírně nadměrné teploty v inkubátoru mohou vést ke vzniku obrazců teček, resp. křížového šrafování, a to v důsledku toho, že kov polic poskytuje více tepla než okolní plochy. Tečky s vyšší hustotou buněk naznačují lepší růst buněk, které nejsou v kontaktu s kovem; křížové šrafování naznačuje, že buňky dávají přednost teplejším oblastem před kovem. | Podle potřeby upravte teplotu inkubátoru a dbejte na minimalizaci doby, kdy jsou inkubátory otevřené, což vede k tepelným ztrátám. Lze také použít atrapy nádob naplněné médiem, které izolují proti kontaktu s policemi. |
| Nerovná police inkubátoru může způsobit nerovnoměrnou hustotu buněk | Před použitím a po čištění a údržbě inkubátoru vyrovnejte police. |
| Přítomnost vzduchových bublin v médiích vede ke vzniku čirých pásů (v lahvích s válečky), skvrn bez růstu buněk (v baňkách a miskách) | Přilévejte nebo pipetujte média opatrně, abyste zabránili vzniku vzduchových bublin. |
| Kondenzace vede ke vzniku svislých pruhů (v lahvičkách s válečky a baňkách) | Nedovolte, aby nádoby byly vystaveny nižším teplotám mimo inkubátor déle, než je nutné. Nádoby vyjměte z inkubátoru bezprostředně před použitím. |
| Příliš malý objem média vytváří prstenec zvýšené hustoty buněk podél bočních stěn misek a baněk. To je způsobeno zakřivením menisku, který vytváří oblast chudou na média ve středu baňky nebo jamky. | Dodejte do kultivačních nádob přiměřené množství médií. Obecné doporučení je 0,2-0,3 ml média na cm2 růstové plochy |
Obecné tipy a techniky pro prevenci a odstranění problémů s růstem buněk
Klíčem k včasné diagnostice a léčbě problémů s růstem buněk je kromě dodržování správných postupů sterility, které zabraňují mikrobiální a chemické kontaminaci, časté pozorování kultur a podrobné vedení záznamů. Důležité je také zvážit, zda je nejefektivnějším postupem podrobné a časově náročné hledání viníka (viníků) špatného růstu buněk, nebo zda je lepší jednoduše začít znovu se všemi novými činidly, zásobami a materiály.
Pozorujte opatrně
Chcete-li vyřešit problém s růstem buněk, musíte si nejprve uvědomit, že problém existuje. Mnoho problémů s růstem je nenápadných, proto je nutné pravidelné a podrobné pozorování nejen některých, ale všech kultivačních nádob v experimentu. Rychlé posouzení pod mikroskopem nemusí být dostačující; mnoho specifických vzorců růstu se projeví až po fixaci a obarvení buněk. Pravidelně zkoumejte média a další činidla a pátrejte po kontaminaci.
Zaznamenávejte s přesností
Při snaze diagnostikovat a řešit problémy se špatným růstem buněk může mít dobré poznámky o všech aspektech kultivace, které ušetří čas, peníze a unikátně modifikované buňky, jako jsou knockoutové linie. Například normalizace hustoty buněk a zaznamenávání počtu průchodů zásobních buněk je zásadní pro zjištění, zda je zásoba pravděpodobně zdrojem problému, či nikoli. Stejně tak, než dojdeme k závěru, že na vině je určitá šarže média, musíme si být nejprve jisti, do kterých kultivačních misek byla tato šarže dodána.
Důležité informace, které je třeba zaznamenat, zahrnují zdroj, důkaz o identitě a absenci kontaminace, číslo pasáže, hustotu buněk a protokoly o zmrazení a skladování všech zásobních lahviček. U všech použitých činidel by měly být zaznamenány také složky (a koncentrace), čísla šarží a data prvního otevření/použití. Měla by být zaznamenána také čísla šarží všech kultivačních nádob. Podrobné protokoly pro všechny aspekty buněčné kultivace by měly být standardizovány a dodržovány. Přesné a podrobné označení všech zásobních lahviček a kultivačních nádob je nezbytné. Věnujte pozornost drobným detailům, například kdy se čistí a servisují inkubátory, kdy se vyměňují nádržky CO2 a kdy se v kultivační místnosti naposledy prováděla kontrola na přítomnost mykoplazmy, a zaznamenejte si vše, co se vymyká běžným zvyklostem.
Vědět, kdy snížit ztráty
Někdy není tak důležité najít přesný zdroj problému jako jeho odstranění, a proto může být nákladově i časově efektivnější odstranit více potenciálních příčin špatného růstu najednou než se snažit izolovat přesný problém. Například může být rozumnější začít znovu s novou zásobní lahvičkou buněk a všemi novými médii, séry, pufry atd., než zkoušet nové šarže každého z nich nezávisle na sobě, dokud se neobjeví viník.
Nejdůležitější informace
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
