Testy životaschopnosti a proliferace buněk

• Testy proliferace syntézy DNA
• Testy metabolické proliferace
• Luminiscenční testy životaschopnosti buněk
• Fluorescenční testy proliferace
• 3D buněčné kultury- trojité barvení živých/neživých/celkových buněk
• počítání buněk pomocí trypanové modři

Úvod

Testy k měření buněčné proliferace, životaschopnosti buněk a cytotoxicity se běžně používají ke sledování reakce a stavu buněk v kultuře po působení různých podnětů. Správná volba metody testu závisí na počtu a typu použitých buněk a také na očekávaném výsledku. Testy buněčné proliferace mohou sledovat počet buněk v průběhu času, počet buněčných dělení, metabolickou aktivitu nebo syntézu DNA. Počítání buněk pomocí barviv pro stanovení životaschopnosti, jako je trypanová modř nebo kalcein-AM, může poskytnout jak rychlost proliferace, tak procento životaschopných buněk.

Přehled testů životaschopnosti a proliferace buněk

Název	Přehled	Způsob detekce	Výhoda	Nevýhoda
BrdU Assay	BrdU se začleňuje do nově syntetizované DNA a detekuje se pomocí protilátky anti-Brdu	ICC, IHC, FACS, ELISA	Kinetika buněčného cyklu, rozlišení jedné buňky  /td>	Dlouhý protokol Potenciální poškození DNA
EdU Assay	Podobná technice BrdU, ale využívá detekci Click-Chemistry bez protilátek	ICC, IHC, FACS, ELISA	Méně toxická než BrdU Rychlejší protokol . Žádná denaturace DNA	Nákladná činidla
MTT Assay	MTT, žlutý tetrazol, se v živých buňkách redukuje na fialový formazan	Spektrofotometr	Rychlý protokol Vysoká propustnost	Koncový test Nadhodnocení životaschopnosti Závěrečný solubilizační krok
Test XTT	Aktivně dýchající buňky přeměňují XTT na ve vodě rozpustný, oranžově zbarvený formazanový produkt	Spektrofotometr	Vysoká citlivost Velký dynamický rozsah Rozpustný ve vodě	Koncový test Nadhodnocení životaschopnosti
Test WST-1	WST-1 se štěpí na rozpustný formazan složitým buněčným mechanismem, který probíhá především na povrchu buněk.	Spektrofotometr	Nejvyšší citlivost Rychlejší protokol	Koncový test Nadhodnocení životaschopnosti
Luminiscenční test ATP	Test na bázi světluščí luciferázy pro kvantifikaci ATP v buněčných kulturách; používá se k měření životaschopnosti buněk	Spektrofotometr	Spektrofotometr	Vyžaduje lýzu buněk
Ki67	Protilátky proti jadernému proteinu Ki-67 lze použít k měření buněčné proliferace.	ICC, IHC, WB	In vivo aplikace	Obtížně kvantifikovatelné Vyžaduje fixaci
CFSE, nefluoreskující barvivo propouštějící buňky, je štěpeno intracelulárními esterázami za vzniku zelené fluorescence.	ICC, FACS	Analýza živých buněk Dlouhé experimenty Kompatibilní s lymfocyty	Toxičnost Emise zeleného kanálu
Testy živých/mrtvých buněk	Simultánní fluorescenční barvení živých, mrtvých a celkových buněk pomocí kalceinu-AM (živé buňky), propidium jodidu (PI, mrtvé buňky) a Hoechstu 33342 (celkové buňky).	ICC, FACS	Analýza živých buněk Rychlý protokol Rozlišení jedné buňky	Autofluorescence pozadí
Trypan Blue	Test vyloučení barviva: životaschopné buňky barvivo nepřijímají, ale mrtvé buňky jsou pro něj propustné	Mikroskopie	Nízké náklady	Variabilita Nepřesné

Testy proliferace syntézy DNA

Test proliferace buněk s BrdU

Buněčnou proliferaci lze studovat sledováním inkorporace radioizotopu [3H]-thymidinu do buněčné DNA s následnou autoradiografií. Alternativně lze místo thymidinu použít 5-bromo-2′-deoxy-uridin (BrdU testy). Buňky, které inkorporovaly BrdU do své DNA, lze snadno detekovat pomocí monoklonální protilátky proti BrdU a sekundární protilátky konjugované s enzymem nebo fluorochromem.

Obrázek 1. A, Proliferující buňky v oku kuřecího embrya E4 pomocí barvení BrdU B, validace protilátky proti BrdU pomocí kamptotecinu. Při ošetření buněk Jurkat látkou zastavující buněčný cyklus kamptothecinem jsou cirkulující buňky zachyceny ve fázi přechodu G1/S.

EdU proliferační testy

Baseclick EdU proliferační testy poskytují účinnou metodu fluorescenční detekce replikující se DNA. Modifikovaný nukleosid EdU se přidává do živých buněk a začleňuje se do replikující se DNA. Cu indukovaná click chemie umožňuje rychlé připojení fluorescenčních sond k EdU. To umožňuje kvantitativní způsob monitorování buněk, které se množí. Testy jsou k dispozici v různých formátech pro mikroskopické zobrazování, průtokovou cytometrii, vysoce výkonný screening a pro in vivo experimenty. K dispozici jsou čtyři různé fluorescenční sondy s excitačním píkem 488, 555, 594 a 647 pro možnost multiplexování s jinými fluorescenčními sondami.

Obrázek 2. Soupravy Edu-Click pro proliferaci buněk obsahují EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) do DNA během aktivní syntézy DNA a měří se pomocí fluorescenční detekční metody click-chemistry.

Metabolické testy proliferace

Testy, které měří metabolickou aktivitu, jsou vhodné pro analýzu proliferace, životaschopnosti a cytotoxicity. Redukce tetrazoliových solí, jako je MTT, .XTT, a WST-1 na barevné formazanové sloučeniny nebo bioredukce resazurinu probíhá pouze v metabolicky aktivních buňkách. Aktivně proliferující buňky zvyšují svou metabolickou aktivitu, zatímco u buněk vystavených toxinům se aktivita sníží.

MTT testy buněčné proliferace

MTT  (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- difenyltetrazolium bromid; thiazolylová modř) je ve vodě rozpustná tetrazoliová sůl, která při přípravě v médiích nebo roztocích solí bez fenolové červeně poskytuje nažloutlý roztok. Rozpuštěný MTT se štěpením tetrazolového kruhu enzymy dehydrogenázy mění na nerozpustný fialový formazan. Tento ve vodě nerozpustný formazan lze rozpustit pomocí isopropanolu nebo jiných rozpouštědel a rozpuštěný materiál se měří spektrofotometricky pomocí absorbance jako funkce koncentrace převedeného barviva.

XTT testy buněčné proliferace

Na rozdíl od MTT je produkt štěpení XTT je rozpustný ve vodě; není proto nutný solubilizační krok. Tetrazoliová sůl XTT se štěpí na formazan složitým buněčným mechanismem. Tato biologická redukce probíhá pouze v životaschopných buňkách a souvisí s produkcí NAD(P)H prostřednictvím glykolýzy. Množství vytvořeného formazanového barviva přímo souvisí s počtem metabolicky aktivních buněk v kultuře.

Testy proliferace buněk WST-1

Stabilní tetrazoliová sůl WST-1 se štěpí na rozpustný formazan složitým buněčným mechanismem, který probíhá především na povrchu buněk. Tato bioredukce je do značné míry závislá na glykolytické produkci NAD(P)H v životaschopných buňkách. Množství vytvořeného formazanového barviva přímo souvisí s počtem metabolicky aktivních buněk v kultuře.

Průvodce protokolem: WST-1 Assay pro stanovení životaschopnosti a proliferace buněk. Protokoly, nejčastější dotazy a řešení problémů

Obrázek 3. MTT test je kolorimetrický test pro hodnocení proliferace buněk na základě metabolické aktivity. NAD(P)H-dependentní buněčné oxidoreduktázové enzymy odrážejí počet přítomných životaschopných buněk. Tyto enzymy jsou schopny redukovat žluté tetrazoliové barvivo MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid na nerozpustný formazan, který má fialovou barvu.

 Luminiscenční testy životaschopnosti buněk

Protože ATP je indikátorem metabolicky aktivních buněk, lze počet životaschopných buněk hodnotit na základě množství dostupného ATP. Test ATP Cell Viability Luciferase Assay nabízí vysoce citlivý homogenní test pro kvantifikaci ATP v buněčných kulturách. Tato souprava využívá světluškovou luciferázu k oxidaci D-Luciferinu a výslednou produkci světla k posouzení množství ATP dostupného v buněčných kulturách. Citlivý postup testu zahrnuje jednorázové přidání koktejlu pro detekci ATP přímo do buněk kultivovaných v médiu doplněném sérem. Není nutné promývání buněk, odstraňování média ani opakované pipetování. Souprava je dostatečně citlivá pro detekci jedné buňky nebo 0,01 pikomolů ATP. Vytvořený signál je lineární v rozmezí šesti řádů. Tím, že je množství ATP vztaženo k počtu životaschopných buněk, má test široké využití, od stanovení počtu životaschopných buněk přes buněčnou proliferaci až po buněčnou cytotoxicitu.

Obrázek 4. Bioluminiscenční test životaschopnosti buněk s ATP luciferázou. Světluška luciferáza využívá ATP k oxidaci D-luciferinu a výsledné produkci světla za účelem posouzení množství dostupného ATP, které koreluje s počtem buněk a jejich životaschopností.

Provádění proliferačních testů s fluorescenčním barvivem

Značení CFSE

5(6)-karboxyfluorescein diacetát N-succinimidyl ester (CFSE) je oblíbenou volbou pro měření počtu dělení, kterými prošla buněčná populace. Po vstupu do buňky je CFSE štěpen intracelulárními esterázami za vzniku fluorescenční sloučeniny a sukcinimidylesterová skupina kovalentně reaguje s primárními aminy na intracelulárních proteinech. Při dělení se intenzita fluorescence každé dceřiné buňky sníží na polovinu což umožňuje jednoduchou detekci počtu dělení buněk pomocí průtokové cytometrie. CFSE se široce používá k měření proliferace lymfocytů, včetně T-buněk.

Dvojité barvení živých/mrtvých buněk

Dvojité barvení živých/mrtvých buněk lze využít pro současnou fluorescenční detekci živých a mrtvých buněk. /CZ/csCalcein-AM je vysoce lipofilní a pro buněčnou membránu propustné barvivo. Ačkoli kalcein-AM sám o sobě není fluorescenční molekulou, kalcein vytvořený z kalceinu-AM esterázou v životaschopné buňce vyzařuje silnou zelenou fluorescenci (λex 490 nm, λem 515 nm). Kalcein-AM proto barví pouze životaschopné buňky. Naproti tomu barvivo barvící jádra Propidium Iodine nemůže projít membránou životaschopné buňky. Do jádra se dostane průchodem neuspořádanými oblastmi mrtvé buněčné membrány a interkaluje s dvojitou šroubovicí DNA, čímž vyzařuje červenou fluorescenci (λex 535 nm, λem 617 nm). Vzhledem k tomu, že kalcein i PI-DNA lze excitovat světlem o vlnové délce 490 nm, je možné pomocí fluorescenčního mikroskopu s jednou excitací současně sledovat živé i mrtvé buňky.

Obrázek 5. Dvojité barvení živých/mrtvých buněk

3D Buněčné kultury - trojité barvení živých/neživých/celkových buněk

Sada pro zobrazování životaschopnosti buněk Sada pro zobrazování životaschopnosti buněk<./a> je tříbarevný test, který lze použít u 2D a 3D buněčných kultur pro současné fluorescenční barvení živých buněk (Calcein-AM), mrtvých buněk (Propidium Iodide/PI) a také celkových buněk (Hoechst 33342).

• Calcein-AM fluoreskuje zeleně po navázání vápníku, přičemž spoléhá na esterázovou aktivitu přítomnou pouze v metabolicky aktivních životaschopných buňkách.
• Propidium jodid  (PI) je jaderné barvivo, které je vyloučeno membránou živých buněk, ale prochází poškozenou membránou mrtvých buněk, interkaluje s DNA a vyzařuje silnou červenou fluorescenci.
• Hoechst 33342 je barvivo pro barvení DNA, které vykazuje nízkou cytotoxicitu. Fluoreskuje modře a používá se jako indikátor celkového počtu buněk.

Počítání životaschopných buněk pomocí trypanové modři

Trypanová modř je jedním z několika barviv doporučených pro použití v postupech vylučování barviva pro počítání životaschopných buněk. Tato metoda je založena na principu, že živé (životaschopné) buňky modré barvivo nepřijímají, zatímco mrtvé (neživé) buňky ano. Životaschopnost buněk lze vypočítat pomocí poměru celkového počtu živých buněk k celkovému počtu buněk (živých a mrtvých). Barvení také usnadňuje vizualizaci celkové morfologie buněk.

POZNÁMKA: Trypanová modř má větší afinitu k sérovým proteinům než k buněčným proteinům. Pokud je pozadí příliš tmavé v důsledku přítomnosti séra v matrici, měly by být buňky před počítáním peletovány a resuspendovány v médiu bez proteinů nebo v solném roztoku.

Obrázek 6. Počítání buněk pomocí hemocitometru a trypanové modři

Materiály

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Odkazy

1. Slater T, Sawyer B, Sträuli U. 1963. Studies on succinate-tetrazolium reductase systems. Biochimica et Biophysica Acta. 77383-393. https://doi.org/10.1016/0006-3002(63)90513-4

2. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65(1-2):55-63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4

3. Denizot F, Lang R. 1986. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Journal of Immunological Methods. 89(2):271-277. https://doi.org/10.1016/0022-1759(86)90368-6

4. Slater T, Sawyer B, Sträuli U. 1963. Studies on succinate-tetrazolium reductase systems. Biochimica et Biophysica Acta. 77383-393. https://doi.org/10.1016/0006-3002(63)90513-4