3D kultivace organoidů: Nové in vitro modely vývoje a onemocnění

Přehled sekcí

• 2D vs. 3D systémy buněčných modelů
• Co jsou organoidy?
• Organoidy vs. Sféroidy
• Jak se organoidy vytvářejí?
• Použití organoidů
• Související produkty pro buněčné kultury s organoidy

2D vs. 3D buněčné modelové systémy

Modelové systémy jsou hnacím motorem biologického výzkumu, protože umožňují rekapitulaci tělesných procesů a funkcí od molekulární úrovně až po úroveň celého organismu. Lidské tělo se skládá z buněčného i nebuněčného materiálu uspořádaného vysoce specializovaným způsobem. Je obtížné napodobit všechny aspekty lidské biologie pomocí jednoho in vitro modelového systému. 3D buněčné kultury modely představují přesnější reprezentaci přirozeného prostředí, které buňky v živém organismu zažívají, na rozdíl od pěstování buněk na 2D plochých površích.

Omezení stávajícího systému buněčných modelů
Modely zvířat	2D buněčné monovrstvy	3D buněčné agregáty
Rozdíly v biologii člověka a zvířat Omezená využitelnost při zobrazovacích a vysoce výkonných studiích1 Vysoké náklady	Buňky ztrácejí svůj fenotyp Chybí interakce mezi buňkami a matricí Nemohou napodobovat buněčné funkce a signální dráhy jako v podmínkách in-vivo	Přibližně se podobají uspořádání buněk a interakcím /li> Obtížné udržovat dlouhodobé kultury Nedostatečná potence pro sebeobnovu a diferenciaci2

Co jsou organoidy?

Organoidy jsou in-vitro odvozené 3D buněčné agregáty odvozené z primárních tkání nebo&nbspinbsp;kmenových buněk které jsou schopny sebeobnovy, sebeorganizace a vykazují orgánovou funkčnost.³ Organoidy řeší omezení stávajících modelových systémů tím, že poskytují:

• Podobné složení a architekturu jako primární tkáň: Organoidy ukrývají malou populaci samoobnovujících se kmenových buněk, které se mohou diferencovat v buňky všech hlavních buněčných linií s podobnou frekvencí jako ve fyziologickém stavu.
• Relevantní modely in-vivo podmínek: Organoidy jsou biologicky relevantnější pro jakýkoli modelový systém a lze s nimi manipulovat se složkami niky a sekvencí genů.
• Stabilní systém pro prodlouženou kultivaci: Organoidy lze kryokonzervovat jako biobanky a rozšiřovat je donekonečna využitím sebeobnovy, diferenciační schopnosti kmenových buněk a vnitřní schopnosti sebeorganizace.

Obrázek 1. Myší střevní epitelové organoidy. 3D Organoidy byly vytvořeny z dospělé myší střevní tkáně podle protokolu popsaného v článku Clevers et al. Science. 2013. Organoidní buňky začínají vytvářet lumeny a pupenové struktury přibližně 3.-5. den kultivace a kolem 7.-10. dne vytvářejí komplexní struktury podobné kryptám. Tyto domény podobné kryptám jsou funkčně podobné doménám dospělého střeva, kde jsou dělící se LGR5+ střevní kmenové buňky interkalovány Panethovými buňkami umístěnými na bázi krypty.

Buněčné linie

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Organoidy vs. sféroidy

Organoidy i sféroidy jsou buňky kultivované ve 3 rozměrech. Sféroidy jsou často tvořeny z nádorových buněčných linií nebo nádorových biopsií jako volně plovoucí buněčné agregáty v destičkách s velmi nízkou přilnavostí, zatímco organoidy jsou odvozeny z tkáňových kmenových buněk vložených do hydrogelové matrice ECM, jako je Matrigel. Organoidy jsou vysoce komplexní a ve srovnání se sféroidy se více podobají in vivo. Nedávno se ukázalo, že nádorové organoidy umožňují předpovídat, jak dobře pacienti reagují na léky proti rakovině, což napomáhá personalizované medicíně.

Obrázek 2. Organoidy vs. sféroidy. Organoidy odvozené z kmenových buněk mají ve srovnání s nádorovými sféroidy in vivo podobnější fenotypy s vyšší komplexitou tkání.

Jak vznikají organoidy?

Organoidy se generují buď z primárních tkání, nebo z pluripotentních kmenových buněk (indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) nebo embryonálních kmenových buněk (ESC)) poskytnutím vhodných fyzikálních a biochemických signálů⁴.

Fyzikální podněty: Poskytují podporu pro uchycení a přežití buněk. Příkladem jsou kolagen, fibronektin, entaktin a laminin.

Biochemické signály: Modulují signální dráhy, čímž ovlivňují proliferaci, diferenciaci a sebeobnovu. Mezi příklady patří EGF, FGF10, HGF, R-spondin, WNT3A, kyselina retinová, inhibitory GSK3β, inhibitory TGF-β, inhibitory HDAC, inhibitory ROCK, noggin, aktivin A, inhibitory p38 a gastrin.

Kvalifikované činidla Organoid

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Aplikace organoidů

Organoidy jsou fyziologicky relevantní a vhodné pro molekulární a buněčné biologické analýzy, což je velkým příslibem jak pro základní výzkum, tak pro translační aplikace.  

Vývojová biologie

Organoidy odvozené z ESC, iPSC si zachovávají vlastnosti svého vývojového stadia a pomáhají při studiu procesu embryonálního vývoje, specifikace linií a homeostázy tkání. Rovněž vrhají světlo na vývoj kmenových buněk a jejich niky.

• Vývoj orgánů, jako je mozek²⁴, slinivka²⁵ a žaludek⁷ byl studován prostřednictvím postupných diferenciačních kroků vyvolaných modulací signálních drah Wnt, BMP a FGF

Patologie infekčních onemocnění

Organoidy představují všechny složky orgánů a jsou vhodné ke studiu infekčních onemocnění postihujících specializované typy lidských buněk.

• Plicní organoidy odvozené z iPSC od zdravého dítěte nesoucího nulové alely genu pro interferonový regulační faktor 7  použité ke studiu replikace viru chřipky ²⁶
  
• Organoidy předního mozku odvozené z lidských iPSC byly použity ke studiu infekce virem zika na nervových progenitorech²⁷

Regenerativní medicína

Transplantace organoidů odvozených z dospělých kmenových buněk pomáhá nahradit poškozený orgán nebo tkáň. Kromě toho lze při léčbě monogenních dědičných onemocnění využít možnosti genové korekce pomocí technologie CRISPR/Cas9.

• Organoidy tenkého střeva si při transplantaci na myších modelech²⁸

zachovaly vlastnosti tenkého střeva, jako je tvorba klků a přítomnost Panetha.Testování toxicity a účinnosti léčiv

Možnost testovat účinnost a toxicitu léčiv vůči reprezentativním cílům/orgánům (střevo, játra a ledviny) by mohla potenciálně omezit etické problémy spojené s používáním zvířat.

• K prokázání nefrotoxicity cisplatiny ¹¹
byly použity organoidy Hymanových ledvin <./ul>

Personalizovaná medicína

Organoidy odvozené z dospělých kmenových buněk jednotlivých pacientů umožňují testování odpovědi na léčivo ex vivo.


• Střevní organoidy byly využity k identifikaci možností léčby pacientů se vzácnými mutacemi CFTR²⁹
  
• Nádorové organoidy lze využít k posouzení odpovědi na léčivo na úrovni jednotlivých pacientů.
  

Obrázek 3. Tvorba organoidů z primárních tkání a pluripotentních kmenových buněk a jejich aplikace.

Tabulka 1.Přehled růstových faktorů a biochemických látek používaných při vývoji různých typů buněk organoidů.

Organoidy	Zdroj	Podmínky kultivace	Typy buněk v organoidech	Reference<./th>
Žaludek
	hPSC	Indukce endodermu:Inhibitor rocku (Y-27632), Activin A, BMP5 Generování sféroidů:WNT, FGF, Noggin, Kyselina retinová Tvorba organoidů:Noggin, kyselina retinová, EGF Zrání: EGF	LGR5+ buňky, slizniční buňky, endokrinní buňky žaludku	7
	hAdSC	EGF, Rspondin, Noggin, FGF10, WNT, Gastrin, Nikotinamid a Inhibitor TGFβ	LGR5+ buňky, buňky jamkové sliznice, buňky žlázové sliznice, hlavní buňky a enteroendokrinní buňky	13
<Střevní
	hPSC	Indukce endodermu:Activin A, BMP4 Diferenciace zadního střeva (tvorba sféroidů): FGF4, WNT3A Tvorba organoidů:FGF4, WNT3A Zrání:RSpondin1, Noggin, EGF, FGF4, WNT	Enterocyty, Gobletovy, Panethovy a enteroendokrinní buňky	30
	hAdSC	Vytvoření :EGF, Rspondin, Noggin, WNT3A, Nikotinamid, Gastrin, TGFβinhibitor, inhibitor p38 Diferenciace : Bez WNT3A, inhibitor MAP kinázy p38 a nikotinamid	Deriváty střevního epitelu a kmenové buňky	31
Colon
	hAdSC	Vytvoření:	Vypracování:EGF, Rspondin, Noggin, WNT3A, Nikotinamid, Gastrin, Inhibitor TGFβ, inhibitor p38 Diferenciace : Bez WNT3A, inhibitor p38 MAP kinázy a nikotinamid	Epitelové buňky a mezenchymální deriváty	31
.Játra
	hAdSC	Vytvoření:Noggin, WNT, Inhibitor ROCK Diferenciace:Gastrin, EGF, Rspondin, FGF10, hepatocytární růstový faktor, nikotinamid, inhibitor TGFβ, Forskolinu	funkční hepatocytární buňky	14
	hiPSC	Indukce endodermy:Aktivin A Jaterní specifikace: BMP4, FGF2, hepatocytární růstový faktor Zrání: Oncostatin M	Funkční buňky hepatocytů	32
Pankreas
	hAdSc	Vytvoření:Inhibitory TGFβ, Noggin, R-Spondin 1, WNT3A, EGF, FGF10, Nikotinamid Diferenciace:Není uvedeno	Epiteliální duktální buňky	23
Prostata
	hAdSc	EGF, R-Spondin1, Noggin, TGF-β inhibitor, inhibitor p38 MAP kinázy, FGF10, FGF2, PGE2, Nikotinamid a DHT	Diferencované CK5+ bazální a CK8+ luminální buňky	17
Plicní
	hPSC	DHT	Mezenchymální a plicní epitelové buňky	33
Mozkové
	hPSC	Neurální indukce:doplněk N2, NEAA a heparin Diferenciace:doplněk N2, 2-merkaptoetanol, inzulin Zrání:vitamín A, kyselina retinová	Populacerogenitorů, které produkují zralé kortikální neurony	24
Klidové buňky./b>
	hPSC	Indukce středního mezodermu:Wnt, inhibitor GSK3α Tvorba organoidů: inhibitor GSK3α, FGF9	Nefrony a endotelové buňky	11, 34

Související produkty pro organoidní buněčné kultury

Cultureware

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Enzymy

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Organoidní matrice

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Média a kultivační činidla

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Růstové faktory a cytokiny

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Malé molekuly

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Reagencie pro histologii

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Odkazy

1. Shanks N, Greek R, Greek J. 2009. Are animal models predictive for humans?. Philos Ethics Humanit Med. 4(1):2. https://doi.org/10.1186/1747-5341-4-2

2. Yin X, Mead B, Safaee H, Langer R, Karp J, Levy O. 2016. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18(1):25-38. https://doi.org/10.1016/j.stem.2015.12.005

3. Lancaster MA, Knoblich JA. 2014. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345(6194):1247125-1247125. https://doi.org/10.1126/science.1247125

4. Clevers H. 2016. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165(7):1586-1597. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.082

5. Eiraku M, Sasai Y. 2012. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Current Opinion in Neurobiology. 22(5):768-777. https://doi.org/10.1016/j.conb.2012.02.005

6. Nakano T, Ando S, Takata N, Kawada M, Muguruma K, Sekiguchi K, Saito K, Yonemura S, Eiraku M, Sasai Y. 2012. Self-Formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina from Human ESCs. Cell Stem Cell. 10(6):771-785. https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.05.009

7. McCracken KW, Catá EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, Tsai Y, Mayhew CN, Spence JR, Zavros Y, et al. 2014. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516(7531):400-404. https://doi.org/10.1038/nature13863

8. Wong AP, Bear CE, Chin S, Pasceri P, Thompson TO, Huan L, Ratjen F, Ellis J, Rossant J. 2012. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat Biotechnol. 30(9):876-882. https://doi.org/10.1038/nbt.2328

9. Huang SXL, Islam MN, O'Neill J, Hu Z, Yang Y, Chen Y, Mumau M, Green MD, Vunjak-Novakovic G, Bhattacharya J, et al. 2014. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32(1):84-91. https://doi.org/10.1038/nbt.2754

10. Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang R, Ueno Y, Zheng Y, Koike N, et al. 2013. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499(7459):481-484. https://doi.org/10.1038/nature12271

11. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, Parton RG, Wolvetang EJ, Roost MS, Chuva de Sousa Lopes SM, et al. 2015. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526(7574):564-568. https://doi.org/10.1038/nature15695

12. Sato T, Clevers H. 2013. Growing Self-Organizing Mini-Guts from a Single Intestinal Stem Cell: Mechanism and Applications. Science. 340(6137):1190-1194. https://doi.org/10.1126/science.1234852

13. Bartfeld S, Bayram T, van de Wetering M, Huch M, Begthel H, Kujala P, Vries R, Peters PJ, Clevers H. 2015. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148(1):126-136.e6. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.09.042

14. Huch M, Gehart H, van Boxtel R, Hamer K, Blokzijl F, Verstegen M, Ellis E, van Wenum M, Fuchs S, de Ligt J, et al. 2015. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160(1-2):299-312. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.050

15. Huch M, Dorrell C, Boj SF, van Es JH, Li VSW, van de Wetering M, Sato T, Hamer K, Sasaki N, Finegold MJ, et al. 2013. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494(7436):247-250. https://doi.org/10.1038/nature11826

16. Huch M, Bonfanti P, Boj SF, Sato T, Loomans CJM, van de Wetering M, Sojoodi M, Li VSW, Schuijers J, Gracanin A, et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32(20):2708-2721. https://doi.org/10.1038/emboj.2013.204

17. Karthaus W, Iaquinta P, Drost J, Gracanin A, van Boxtel R, Wongvipat J, Dowling C, Gao D, Begthel H, Sachs N, et al. 2014. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159(1):163-175. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.08.017

18. Linnemann JR, Miura H, Meixner LK, Irmler M, Kloos UJ, Hirschi B, Bartsch HS, Sass S, Beckers J, Theis FJ, et al. 2015. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142(18):3239-3251. https://doi.org/10.1242/dev.123554

19. Maimets M, Rocchi C, Bron R, Pringle S, Kuipers J, Giepmans B, Vries R, Clevers H, de Haan G, van Os R, et al. 2016. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6(1):150-162. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2015.11.009

20. Nanduri L, Baanstra M, Faber H, Rocchi C, Zwart E, de Haan G, van Os R, Coppes R. 2014. Purification and Ex Vivo Expansion of Fully Functional Salivary Gland Stem Cells. Stem Cell Reports. 3(6):957-964. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.09.015

21. DeWard A, Cramer J, Lagasse E. 2014. Cellular Heterogeneity in the Mouse Esophagus Implicates the Presence of a Nonquiescent Epithelial Stem Cell Population. Cell Reports. 9(2):701-711. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.09.027

22. Mondrinos MJ, Jones PL, Finck CM, Lelkes PI. 2014. Engineering De Novo Assembly of Fetal Pulmonary Organoids. Tissue Engineering Part A. 20(21-22):2892-2907. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2014.0085

23. Boj S, Hwang C, Baker L, Chio I, Engle D, Corbo V, Jager M, Ponz-Sarvise M, Tiriac H, Spector M, et al. 2015. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160(1-2):324-338. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.12.021

24. Lancaster MA, Renner M, Martin C, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA. 2013. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501(7467):373-379. https://doi.org/10.1038/nature12517

25. Greggio C, De Franceschi F, Figueiredo-Larsen M, Gobaa S, Ranga A, Semb H, Lutolf M, Grapin-Botton A. 2013. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140(21):4452-4462. https://doi.org/10.1242/dev.096628

26. Ciancanelli MJ, Huang SXL, Luthra P, Garner H, Itan Y, Volpi S, Lafaille FG, Trouillet C, Schmolke M, Albrecht RA, et al. 2015. Life-threatening influenza and impaired interferon amplification in human IRF7 deficiency. Science. 348(6233):448-453. https://doi.org/10.1126/science.aaa1578

27. Fukuda M, Mizutani T, Mochizuki W, Matsumoto T, Nozaki K, Sakamaki Y, Ichinose S, Okada Y, Tanaka T, Watanabe M, et al. 2014. Small intestinal stem cell identity is maintained with functional Paneth cells in heterotopically grafted epithelium onto the colon. Genes Dev.. 28(16):1752-1757. https://doi.org/10.1101/gad.245233.114

28. Dekkers JF, Wiegerinck CL, de Jonge HR, Bronsveld I, Janssens HM, de Winter-de Groot KM, Brandsma AM, de Jong NWM, Bijvelds MJC, Scholte BJ, et al. 2013. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19(7):939-945. https://doi.org/10.1038/nm.3201

29. Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA, Kuhar MF, Vallance JE, Tolle K, Hoskins EE, Kalinichenko VV, Wells SI, Zorn AM, et al. 2011. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470(7332):105-109. https://doi.org/10.1038/nature09691

30. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, van Es JH, van den Brink S, van Houdt WJ, Pronk A, van Gorp J, Siersema PD, et al. 2011. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141(5):1762-1772. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.07.050

31. Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, North PE, Dalton S, Duncan SA. 2010. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51(1):297-305. https://doi.org/10.1002/hep.23354

32. Dye BR, Hill DR, Ferguson MA, Tsai Y, Nagy MS, Dyal R, Wells JM, Mayhew CN, Nattiv R, Klein OD, et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. 4 https://doi.org/10.7554/elife.05098

33. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Little MH. 2016. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 11(9):1681-1692. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.098