Protokoly Northern & Southern Blot

Protokol jižního blotu
Protokol severního blotu

Co je to Northern & Southern Blotting?

Přenos makromolekul, jako jsou nukleové kyseliny a proteiny, na pevnou fázi membránového nosiče se nazývá blotting. Fragmenty molekul DNA a RNA oddělené gelovou elektroforézou se přenášejí na nylonovou nebo nitrocelulózovou membránu v procesu označovaném jako Southern, respektive Northern blotting. Southern blotting zavedl Edwin Southern v roce 1975 jako metodu detekce specifických sekvencí DNA ve vzorcích DNA. Další techniky blottingu, které z této metody vznikly, byly označeny jako Northern (pro RNA), Western (pro proteiny), Eastern (pro posttranslační modifikace proteinů) a Southwestern (pro interakce DNA s proteiny) blotting.

Protokoly Southern a Northern blottingu zahrnují následující hlavní kroky:

• Purifikace DNA/RNA: Extrakce a přečištění DNA/RNA buď z buněk, nebo z tkáňových zdrojů.
• Digestace DNA: DNA se pomocí restrikčních enzymů rozdělí na fragmenty. Tento krok není nutný pro RNA.
• Gelová elektroforéza: Oddělte fragmenty DNA na agarózovém gelu. Vzorky RNA lze oddělit na agarózovém gelu s formaldehydem jako denaturační látkou, která omezuje sekundární struktury molekul RNA.
• Přenos: Přeneste fragmenty DNA/RNA z gelu na nylonovou membránu.
• Prehybridizace (blokování): Nylonovou membránu promyjte prehybridizačním roztokem obsahujícím DNA lososích spermií, aby se zablokovaly nespecifické interakce DNA a snížil šum na pozadí. Případně použijte pufr PerfectHyb™ Plus, který k blokování nevyžaduje DNA lososích spermií.
• Příprava sondy: Připravte si čerstvou DNA sondy a označte ji pomocí ³²P alfa značeného dCTP.
• Hybridizace: Inkubujte blot se značenou sondou.
• Detekce sondy: Detekce sondy a zájmové sekvence DNA/RNA expozicí filmu při -80 °C.

Obrázek 1. Kroky při postupu blotování DNA/RNA

Protokol pro southern blotting

Potřebný materiál

• Reagencie pro izolaci a čištění DNA
  
• Reagencie pro restrikční štěpení DNA
  
• Reagencie a pufry pro elektroforézu v agarózovém gelu
  
• Aparatura pro elektroforézu v agarózovém gelu
  
• Whatmanovy filtrační papíry
  
• Papírové utěrky
  
• Pozitivně nabitá nylonová membrána
  
• D DNA lososích spermií
  
• Hybridizační zkumavka
  
• Rentgenové filmy
  
  

Potřebné náplně

• 10X TBE (93290), používá se při gelové elektroforéze. Pufr TAE (65497) lze použít místo TBE pro větší fragmenty DNA. Případně místo TAE nebo TBE použijte pufr Bionic™ (B6185) pro získání ostřejších pásů za kratší dobu. Pufr 10X TBE můžete připravit z následujících činidel:
  
  TRIS 1. Pufr 10X TBE můžete použít k přípravě vzorků.3 M
  Kyselina boritá 450 mM
  EDTA 25 mM
  
  
• 20X SSPE (S2015), který se používá jako pufr pro předhybridizaci a přenos. Místo SSPE lze v podobných protokolech blotování použít 20X SSC (93017). Alternativně můžete připravit roztok 20X SSPE s následujícími činidly:
  
  NaCl 2,98 M
  EDTA 0,02 M
  Fosfátový pufr (pH 7,4) 0.2M
  
  
• Denaturační roztok (N1531), který se používá k denaturaci dsDNA, čímž se zpřístupní sondě. Alternativně si můžete připravit 1X denaturační roztok s následujícími činidly:
  
  NaCl 1,5 M
  NaOH (S5881) 0.5 N
  Upravte pH na ~13
  
  
• Neutralizační roztok (N6019), který se používá k neutralizaci gelu po denaturaci dsDNA. Alternativně si můžete připravit 1X neutralizační roztok s následujícími činidly:
  
  NaCl 1,5 M
  TRIS HCl 1 M
  Upravte pH na 7. V případě, že je roztok neutralizován, můžete jej použít k přípravě neutralizačního roztoku.5
  
  
• *Denhardtův roztok (D2532), který se používá během prehybridizace k blokování nespecifických hybridizací DNA. Alternativně si můžete připravit 50x Denhardtův roztok s následujícími činidly:
  
  Hovězí sérový albumin (A7906) 1%
  Ficoll (F2637) 1%
  Polyvinylpyrolidon (PVP40) 1%
  
  Rozpusťte složky ve vodě na konečný objem 50 ml. Sterilizujte filtrací.
• *2X předhybridizační roztok (P1415), který se používá k přípravě membrány pro hybridizaci sondy. Alternativně můžete připravit 1X prehybridizační roztok (100 ml) s následujícími činidly:
  
  20X SSPE 30 ml
  100X Denhardtův roztok 10 ml
  10% SDS 10 ml
  Voda 50 ml
  
  
• *Hybridizační roztok (H7140), používaný během hybridizačního kroku. Alternativně si můžete připravit hybridizační roztok (100 ml) s následujícími činidly:
  
  20X SSPE 30 ml
  10% SDS 10 ml
  Voda 60 ml
  
  
• 1X sondový pufr, který se používá při míchání sond. (100 µl; připravte si čerstvé):
  
  1 M TRIS, pH 7,6 50 µl
  2 MgCl₂ 5 µl
  0.5 M DTT 10 µL
  Voda 35 µL
  
  
• 1X směs sond (27 µL):
  
  
  Sondový pufr 2,7 µL
  Oligonukleotidová sonda (0,7 µL)
  Oligonukleotidová sonda (0.2 µg/µL) 2 µL
  Fosfonukleotidová kináza T4 (PNK) 1 µL
  Voda 11.3 µL
  ³²P-ATP 10 µL
  
  
• 6X Nízkostringový promývací roztok, který se používá k odstranění hybridizací s nízkou homologií a ke snížení šumu pozadí. Připravte 600 ml promývacího roztoku s použitím následujících činidel:
  
  20X SSPE 180 ml
  10% SDS 12 ml
  Voda 408 ml
  
  
• 1X promývací roztok s vysokou strnulostí, který se používá k odstranění úzce homologních hybridizací a dalšímu snížení šumu pozadí. Připravte 600 ml promývacího roztoku s použitím následujících činidel:
  
  20X SSPE 30 ml
  10% SDS 12 ml
  Voda 558 ml

*PerfectHyb™ Plus Hybridization Buffer (H7033) lze použít místo Denhardta, předhybridizačního a hybridizačního roztoku. PerfectHyb™ Buffer byl optimalizován tak, aby poskytoval maximální signál s minimálním pozadím při hybridizaci trvající pouhé 1 až 2 hodiny. PerfectHyb™ Plus byl vyvinut tak, aby fungoval v jakémkoli hybridizačním protokolu, s použitím jakéhokoli typu sondy a na jakémkoli typu membrány (kladně nabitá nebo neutrální nylonová a nitrocelulózová). 

Izolace DNA

Sigma-Aldrich nabízí soupravy GenElute™ pro izolaci DNA z rostlin a hub (

Podrobné informace o soupravách GenElute™ jsou uvedeny v příloze.a href="/product/sigma/E5038">E5038), savčích buněk nebo tkání (G1N70, G1N10 a G1N350) a krev (NA2010 a NA2020). Podrobný protokol izolace DNA pomocí souprav GenElute™ lze nalézt zde.

Dodatečně jsou k dispozici soupravy DNAstable^® (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML a 93121-017-1EA) lze použít v případě, že se DNA přepravuje nebo pro skladování a stabilizaci DNA při pokojové teplotě.

Restrikční digesce

Digestujte vzorek DNA pomocí vhodného restrikčního enzymu po dobu 2-24 h při 37 °C. Pokud je vzorek DNA odvozen klonálně, postačí doba trávení 1-2 h. V případě genomové DNA je obvykle nutná inkubace přes noc s přebytkem enzymu (5-10x).

Pokud je to nutné, zahušťujte natrávenou DNA pomocí srážení etanolem. Před separací na gelu musí být stopy ethanolu zcela odstraněny.

Gelová elektroforéza

Rozpusťte natrávenou DNA na agarózovém gelu. TAE by měl být použit pro kratší běhy (<4 hodiny) a větší fragmenty DNA, zatímco TBE by měl být použit pro delší běhy (>4 hodiny) a menší fragmenty DNA (<1kb). Případně použijte pufr Bionic™ Buffer (B6185) pro ostřejší rozlišení pásů za kratší dobu než TAE nebo TBE (více informací naleznete v údajích o pufru Bionic™ Buffer). Obarvěte gel ethidium bromidem a získejte obraz gelu pomocí UV transiluminátoru. Pokud byl ethidium bromid zapracován do agarózy před elektroforézou, lze obraz gelu získat ihned po skončení běhu.

Přenos

V průběhu kroku přenosu se DNA (nebo RNA) z elektroforetického gelu přenese na nylonovou membránu, aby mohla být přístupná sondě pro hybridizaci a detekci.

• Přeneste gel do misky obsahující denaturační roztok v takovém množství, aby zcela pokryl gel. Gel dvakrát promyjte tímto roztokem, přičemž každé promytí trvá 25 min na třepačce.
  
• Gel dvakrát propláchněte vodou.
  
• Gel dvakrát promyjte neutralizačním roztokem, přičemž každé promytí trvá 15 min na třepačce.
  
• Gel dvakrát propláchněte vodou.
  
• Vymyjte gel 20X SSPE na třepačce po dobu 30 min.
  
• Během výše uvedeného kroku připravte Whatmanův papír a membránu pro přenosový postup.
  
• Ostřihněte proužek nylonové membrány (15356) a namočte jej do vody. Ustřihněte proužek Whatmanova papíru širší než gel a namočte jej do 10X SSPE pufru (pufr pro přenos).
  
• Ustřihněte tři proužky Whatmanova papíru téměř stejné velikosti jako gel.
  
• Nastříhejte několik papírových utěrek téměř stejné velikosti jako gel.
  
• Položte stabilní plošinu na tác s 10X SSPE.
  
• Položte na plošinu saranovou fólii. Na saranovou fólii položte Whatmanův papír namočený v 10X SSPE. Ujistěte se, že se nezachytily žádné vzduchové bubliny, a to tak, že je srolujete pomocí skleněné tyčinky. Zajistěte, aby se okraje Whatmanova papíru dotýkaly pufru SSPE v zásobníku. Tento kousek Whatmanova papíru bude fungovat jako knot, který bude vytahovat SSPE pufr nahoru a skrz gel a ukládat pásy DNA na nylonovou membránu.
  
• Položte gel lícem dolů na vlhký Whatmanův papír. Membránu umístěte na horní část gelu. Ujistěte se, že se nezachytily žádné vzduchové bubliny, a to tak, že je odvalíte pomocí skleněné tyčinky.
  
• Na membránu položte tři proužky Whatmanova papíru. Ujistěte se, že se nezachytily žádné vzduchové bubliny, a to tak, že je srolujete pomocí skleněné tyčinky.
  
• Položte na ně hromádku papírových utěrek a poté závaží (např. skleněnou desku).
  
• Tuto sestavu nechte stát přes noc, aby došlo k úplnému přenosu fragmentů DNA. Přenos fragmentů DNA do 15 kb trvá přibližně 18 hodin.
  
• Po dokončení přenosu vložte skvrnu do UV síťovače na automatické nastavení. UV síťování se provádí za účelem kovalentního navázání DNA nebo RNA na nylonovou membránu, což zvyšuje hybridizační signály při detekci. Další možností je po přenosu suchou membránu zapéct, čímž dojde k nekovalentnímu, ale polopevnému navázání nukleových kyselin na membránu. DNA nemůže být UV zářením zesíťována na nitrocelulózovou membránu a musí být zapečena.

Obrázek 2. Sestava Southernova/severního blotu

Předhybridizace (blokování)

Krok předhybridizace (známý také jako blokování) se provádí za účelem minimalizace nespecifických vazeb sondy na nylonovou membránu. Jako blokovací činidlo se běžně používá DNA lososího spermatu, aby se zabránilo přilnutí sondy k membráně a zajistilo se, že bude interagovat pouze s požadovanými pásy DNA, které byly přeneseny na membránu. Předhybridizační roztok připravte následujícím způsobem nebo použijte pufr PerfectHyb™ Plus (H7033):

• Předhybridizační roztok zahřejte na 42 °C.
  
• Zahřejte vzorek DNA lososích spermií (D9156) na 95 °C po dobu 5 minut a ihned zchlaďte na ledu.
  
• Přidejte DNA lososích spermií do teplého předhybridizačního roztoku tak, aby konečná koncentrace DNA byla 50 µg/ml.
  
• Vyjměte skvrnu z UV síťovače a opatrně ji srolujte do hybridizační zkumavky.
  
• Přidejte předhybridizační roztok s DNA spermií do hybridizační zkumavky a umístěte ji na 5 h při 42 °C do hybridizační pece.

Hybridizace

K detekci požadované sekvence, která by měla být přítomna na membráně, se použije komplementární vlákno DNA (sonda). Spojením DNA ze dvou různých zdrojů vznikne "hybridní" dsDNA, ale pouze v případě, že jsou obě vlákna homologní.

• Připravte 1X směs sondy a inkubujte ve vodní lázni při 37 °C po dobu 40 min.
  
• Volnou značku (neinkorporovanou sondu) lze odstranit průchodem směsi sond přes kolonku G-25 Sephadex.
  
• Stanovte specifickou aktivitu sondy pomocí kapalinové scintilace.
  
• Ohřejte 10 ml hybridizačního roztoku na 49 °C, přidejte k němu 10-15 X 10⁶ cpm sondy a dobře promíchejte.
  
• Odstraňte předhybridizační roztok z blotu; přidejte hybridizační roztok se značenou sondou. Inkubujte přes noc při 49 °C.
  Poznámka: Alternativně můžete použít PerfectHyb™ Plus pufr (H7033), který hybridizuje mnohem kratší dobu se silnější výtěžností signálu. Další informace o protokolu a údaje naleznete v protokolu PerfectHyb™ Plus.
  
• Ohřejte 6× promývací roztok na 49 °C. Vyhoďte hybridizační roztok z blotu a přidejte 6X promývací roztok.
  
• Ohřejte 6X promývací roztok s nízkou strnulostí na teplotu 49oC. Vyhoďte hybridizační roztok z blotu a přidejte 6X promývací roztok. Nízkostringentní promývací roztok odstraní hybridizace s nízkou homologií, aby byly ponechány interakce s vysokou homologií, čímž se zjemní požadovaný vzorek DNA.
  
• Připravte si 1X vysokostringentní promývací roztok a zahřejte jej na 49oC. Promývejte blot asi 30 sekund a promývací roztok zlikvidujte. Tento krok používá vysoce striktní roztok k dalšímu zjemnění požadované DNA odstraněním úzce homologických hybridizací.
  
• Zkontrolujte aktivitu blotu pomocí Geigerova čítače. Žádoucí jsou hodnoty 10-50 počtů za sekundu s pásy ozařovacích píků. Pokud je pozadí příliš vysoké, promyjte blot znovu 1X promývacím roztokem.

Detekce sondy

• Vložte blot do kazety s fólií vyložené novou saranovou fólií a pečlivě blot zabalte, aby se mezi blotem a fólií nezachytily žádné vzduchové bubliny.
  
• Přeneste kazetu do temné komory a umístěte na skvrnu rentgenový film. Uzavřete kazetu a umístěte ji na noc do teploty -80 °C. Následující den film vyvolejte.
  
• Další rentgenový film lze umístit přes skvrnu a vrátit do -80 °C pro další expozici.

Protokol pro Northern blotting

Protokol pro Northern blotting je podobný protokolu pro Southern blotting. Sekvence RNA se však oddělují na denaturačním agarózovém gelu inkorporovaném formaldehydem.

Izolace RNA

• Izolujte RNA z buněk nebo vzorků tkání pomocí činidla TRI.sup>® (T9424) nebo GenElute™ kit pro savčí buňky nebo tkáně (RTN70, RTN10 a RTN350).
  
• K určení kvality a koncentrace RNA odečtěte absorbance vzorků při vlnové délce 260 nm a 280 nm. Poměr absorbancí, A₂₆₀/A₂₈₀ 1,8-2,1 znamená dobrou kvalitu RNA.

Gelová elektroforéza

• Pomocí pipety opatrně vložte vzorky do jamek. V případě potřeby lze také vložit vhodný marker obsahující fragmenty RNA různých velikostí (R7020, R7644).
  
• Podrobný protokol o denaturaci RNA při elektroforéze v agarózovém gelu naleznete v příručce o denaturaci RNA v gelu.nbsp;Úvod do elektroforézy nukleových kyselin
  

Pokud byl do agarózy před elektroforézou začleněn ethidium bromid, lze obraz gelu získat ihned po provedení.

Přenos

Nastavení přenosu, prehybridizace, hybridizace a detekční protokoly jsou stejné jako u Southern blottingu.

Odkaz

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press.