Přejít k obsahu
Merck
DomůGelová elektroforéza nukleových kyselinProtokoly a úvod do elektroforézy nukleových kyselin

Protokoly a úvod do elektroforézy nukleových kyselin

Úvod
.Agarosová gelová elektroforéza pro DNA
Agarosová gelová elektroforéza pro RNA
Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro DNA
Reference

Úvod - Co je elektroforéza?

Elektroforéza je metoda separace a čištění makromolekul, jako jsou nukleové kyseliny (DNA a RNA) a proteiny, na základě čistého náboje, velikosti a konformace na matrici. Nukleové kyseliny mají díky přítomnosti fosfátové páteře celkový záporný náboj. Proto se pohybují směrem k anodě migrační rychlostí, která závisí pouze na jejich velikosti. Proteiny obsahují celkový kladný nebo záporný náboj; to umožňuje pohyb molekuly proteinu směrem k pH nazývanému izoelektrický bod, při kterém molekula nemá žádný čistý náboj. Denaturací proteinů a jejich jednotným nábojem je možné je oddělit na základě velikosti. Makromolekuly se elektroforézují v matrici nebo gelu tvořeném agarózou nebo polyakrylamidem. Gely vyrobené z těchto polymerů obsahují póry, kterými mohou proteiny a nukleové kyseliny procházet při přiložení napětí.

Agarosová gelová elektroforéza pro DNA

Agarosa je polysacharid získaný z mořských řas a používá se obvykle v koncentracích 0.5 - 2 % pro elektroforézu DNA a RNA. Vytváří mřížku s vhodnou velikostí pórů, která umožňuje pohyb nukleových kyselin ke kladné elektrodě.

Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu

Obrázek 1. Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu

Protokol:

Potřebný materiál a činidla 

  • Agarosová gelová elektroforéza pro DNA
    • Elektroforézní komora s napájecím zdrojem, odlévací misky a hřebeny
    • Bionic™ Buffer (B6185) nebo vhodný pufr pro elektroforézu:

      1X TAE (65497) obsahující:
           0.04 M tris-acetátu (pH 7,6)
           0.001 M EDTA

      NEBO

      1X TBE (93290) obsahující:
           0.13 M Tris (pH 7,6)
           45 mM kyseliny borité
           2.5 mM EDTA

    • Použití zaváděcího pufru (G7654, G2526) nebo připravený v 1X TAE nebo 1X TBE s následujícím:

           50% glycerol
           0.25% bromfenolová modř (B5525)
           0.25% xylénkyanol FF (X4126)

    • BlueView™ Nucleic Acid Stain (modré barvení nukleových kyselin)a href="/product/sigma/T9060">T9060 a T8935), SYBR® Green Nucleic Acid Stain (S9430) nebo ethidium bromid: 0.5 µg/ml připravené v destilované vodě.
    • Transiluminátor

    Předpřipravené agarózové gely

    Sigma-Aldrich nabízí předpřipravené agarózové gely ve formátu 8, 20 a 24 jamek s přidaným ethidium bromidem. Pokud používáte prefabrikované gely, přejděte ke kroku "Provedení gelu".

Případně si odlijte vlastní agarózové gely podle následujícího postupu.

Příprava agarózového roztoku

  • Odměřte příslušné množství agarózového prášku a přidejte ho do 1X TAE pufru v kádince nebo baňce.
    Poznámka: Množství agarózy bude záviset na požadovaném procentuálním podílu gelu. Objem roztoku agarózy musí být připraven podle velikosti použité misky na gel.
  • Agarózu rozpustíte zahřátím na magnetické plotýnce. Případně ji lze zahřívat v mikrovlnné troubě a každou minutu ji otáčet, dokud se agaróza zcela nerozpustí.
  • Když je agaróza ochlazena na 50-60 °C, přidejte do roztoku ethidium bromid (konečná koncentrace 0,5 µg/ml). Další možností je ponořit gel do roztoku ethidium bromidu po elektroforéze.
    DŮLEŽITÉ: Ethidium bromid je karcinogenní látka. Při manipulaci s ethidium bromidem vždy používejte rukavice a roušku.
  • Při chladnutí agarózy připravte vaničku na odlévání gelu tak, aby roztok agarózy nevytékal před ustálením. To lze zajistit použitím přehrážek zásobníku, flexicasteru nebo utěsněním tradiční laboratorní páskou. Umístěte hřeben do drážek a zásobník umístěte do rovnoměrné vodorovné polohy.
  • Roztok agarózy nalévejte pomalu tak, aby byl na zásobníku rovnoměrně rozprostřen a v gelu nebyly zachyceny žádné vzduchové bubliny. Nechte gel při pokojové teplotě ztuhnout.
  • Odstraňte hřebeny a přeneste gel se zásobníkem do hlavní nádrže a naplňte jej 1X elektroforézním pufrem, dokud nebude gel právě pokryt pufrem.

Příprava vzorků DNA

Sigma-Aldrich nabízí soupravy GenElute™ pro izolaci DNA z rostlin a hub (E5038), savčích buněk nebo tkání (G1N70), G1N10 a G1N350) a krev (NA2010 a NA2020).

Z důvodu ochrany izolované DNA před degradací se doporučuje, aby byla DNA rozpouštěna v TE pufru (T9285).

Doplňkově lze použít soupravy DNAstable® (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML a 93121-017-1EA) lze použít v případě, že se DNA přepravuje nebo pro skladování a stabilizaci DNA při pokojové teplotě.

  • Izolujte DNA z buněk nebo tkáně podle standardního protokolu.
  • Minimální koncentrace DNA potřebná pro detekci na agarózovém gelu při barvení ethidium bromidem je 2 ng.
  • Smíchejte vzorky nukleových kyselin s 10x nakládacím pufrem. Obecně postačí 3 µl nakládacího pufru, ale u vzorků menších než 10 µl lze použít menší objem.

Provádění gelu

  • Pomocí pipety opatrně naložte vzorky do jamek. Lze také zavést vhodný marker obsahující fragmenty nukleových kyselin různých velikostí (D7058, D3937, D3812).
  • Na nádržku nasaďte víko a připojte ji k napájení. Typické napětí pro spouštění vzorků v agarózových gelech je 90 - 150 V.
  • Přední stranu barviva byste měli sledovat pomocí oranžové G (O3756), bromfenolové modři (B8026) nebo xylencyanolu (x4126).

Barvení a prohlížení gelů

Gely inkorporované ethidium bromidem:

  • Po elektroforéze přeneste gel do UV transiluminátoru a pořiďte obraz gelu.
  • Vzorky se zobrazí jako světlé proužky.

Gely, které nejsou inkorporovány ethidium bromidem:

  • Přeneste gel po elektroforéze do SYBR® Green Nucleic Acid Stain (naředěný 1:10 000, barví se ve tmě) nebo 0.5 µg/ml barvicího roztoku ethidium bromidu po dobu 15-30 min.
  • Pokud se používá SYBR® Green Nucleic Acid Stain, lze obraz gelu pořídit ihned po barvení.
  • Pokud se používá ethidium bromid, destinujte gel v destilované vodě po dobu 10-30 min, přičemž zajistěte, aby byl gel zcela ponořen ve vodě.
  • Přeneste gel do UV transiluminátoru a pořiďte obraz gelu.
  • Vzorky se zobrazí jako světlé proužky.

Fluorescenční barvení agarózových gelů

Sigma-Aldrich nabízí Nancy-520 (01494), fluorescenční barvivo, které lze použít místo ethidium bromidu. Je bezpečnější, stabilnější a ekologičtější alternativou ethidium bromidu. Nancy-520 má excitační vlnovou délku 520 nm a emisní vlnovou délku 560 nm.

Gely inkorporované s Nancy-520:

  • Nancy-520 lze inkorporovat do agarózy při odlévání gelu (10 µl až 50 ml agarózy).
  • Po skončení běhu pořiďte fluorescenční snímek gelu.

Gely, do kterých není Nancy-520 začleněn:

  • Připravte barvicí roztok přidáním 10 µl Nancy-520 do 50 ml 1X pufru TBE.
  • Po elektroforéze ponořte gel do barvicího roztoku na 1 h ve tmě nad houpacím stolem.
  • Gel propláchněte 1X pufrem TBE po dobu 10-30 s.
  • Pořiďte fluorescenční snímek gelu.  
Systém horizontální elektroforézy

Obrázek 2.Systém horizontální elektroforézy

Agarosová gelová elektroforéza pro RNA

Kvalitu RNA lze posoudit pomocí agarózové gelové elektroforézy, která rozlišuje RNA na základě velikosti a integrity. RNA však vytváří různé sekundární struktury v důsledku rozsáhlého intramolekulárního párování bází, které narušuje migraci na základě velikosti na agarózovém gelu. Proto je třeba molekuly RNA denaturovat pomocí formamidu a formaldehydu.

Protokol: Agarózová gelová elektroforéza pro RNA

Potřebný materiál a činidla

Ujistěte se, že veškeré použité vybavení neobsahuje RNázy a všechny použité pufry jsou vyrobeny ve vodě bez RNáz.

Sigma-Aldrich nabízí pufry pro vzorky RNA s (R1386) nebo bez ethidium bromidu (R4268)

Prefabrikované agarózové gely

Sigma-Aldrich nabízí prefabrikované 1.25% agarózový gel pro RNA (P6222) ve formátu 8 jamek. Tento prefabrikovaný gel neobsahuje ethidium bromid. Pokud používáte předpřipravené gely, pokračujte krokem "Spuštění gelu".

Alternativně si odlijte vlastní agarózové gely následujícím postupem.

Příprava roztoku agarózy

  • Odměřte příslušné množství práškové agarózy a přidejte ji do 1X pufru MESA v kádince nebo baňce.
    Poznámka: Množství agarózy bude záviset na požadovaném procentuálním podílu gelu. Objem roztoku agarózy musí být připraven podle velikosti použité misky na gel.
  • Agarózu rozpustíte zahřátím na magnetické plotýnce. Případně ji lze zahřívat v mikrovlnné troubě a každou minutu ji otáčet, dokud se agaróza zcela nerozpustí.
  • Když je agaróza ochlazena na 50-60 °C, přidejte do roztoku ethidium bromid (konečná koncentrace 0,5 µg/ml). Další možností je ponořit gel do roztoku ethidium bromidu po elektroforéze.
    DŮLEŽITÉ: Ethidium bromid je karcinogenní látka. Při manipulaci s ethidium bromidem vždy používejte rukavice a roušku.
  • Při chladnutí agarózy připravte vaničku na odlévání gelu tak, aby roztok agarózy nevytékal před ustálením. To lze zajistit použitím přehrážek zásobníku, flexicasteru nebo utěsněním tradiční laboratorní páskou. Umístěte hřeben do drážek a zásobník umístěte do rovnoměrné vodorovné polohy.
  • Roztok agarózy nalévejte pomalu tak, aby byl na zásobníku rovnoměrně rozprostřen a v gelu nebyly zachyceny žádné vzduchové bubliny. Nechte gel při pokojové teplotě ztuhnout.
    Vyjměte hřebeny a přeneste gel se zásobníkem do hlavní nádrže a naplňte jej 1X elektroforézním pufrem, dokud nebude gel právě pokryt pufrem.

Příprava vzorků RNA

  • Izolujte RNA z buněk nebo vzorků tkání pomocí TRI Reagent® (T9424) nebo souprava GenElute™ pro savčí buňky nebo tkáně (RTN70, RTN10 a RTN350).
  • K určení kvality a koncentrace RNA odečtěte absorbance vzorků při vlnové délce 260 nm a 280 nm. Poměr absorbancí, A260/A280 1,8-2,1 znamená dobrou kvalitu RNA. Pro účinnou detekci agarózovou elektroforézou je zapotřebí alespoň 5 µg RNA.
  • Smíchejte jeden objem vzorku RNA s 2-5 objemy vzorkovacího pufru.
  • Zahřejte vzorek na teplotu 65 °C po dobu 10 minut a ihned zchlaďte na ledu, aby nedošlo k renaturaci molekul RNA.

Provádění gelu

  • Vyplňte vzorky opatrně do jamek pomocí pipety. V případě potřeby lze také vložit vhodný marker obsahující fragmenty RNA různých velikostí (R7020, R7644).
  • Na nádržku nasaďte víko a připojte ji k napájení. Typické napětí pro spouštění vzorků v agarózových gelech je 90 - 150 V.
  • Přední stranu barviva byste měli sledovat pomocí pyroninu Y (P9172), bromfenolové modři (B8026) nebo xylencyanol (x4126).

Barvení a prohlížení gelů

Gely inkorporované ethidium bromidem:

  • Po elektroforéze přeneste gel do UV transiluminátoru a pořiďte obraz gelu.
  • Vzorky se zobrazí jako světlé proužky.

Gely bez inkorporovaného ethidium bromidu:

  • Gel jemně promývejte v destilované vodě bez RNázy po dobu 10 minut, abyste odstranili formaldehyd.
  • Gel po elektroforéze přeneste do barvicího roztoku SYBR® Green Nucleic Acid Stain (1:10 000) nebo 0,5 µg/ml ethidium bromidu na 15-30 min.
  • Pokud se používá SYBR® Green Nucleic Acid Stain, lze obraz gelu získat ihned po obarvení.
  • Pokud se používá ethidium bromid, destinujte gel v destilované vodě po dobu 10-30 min, přičemž zajistěte, aby byl gel zcela ponořen ve vodě.
  • Přeneste gel do UV transiluminátoru a pořiďte obraz gelu.
  • Vzorky se zobrazí jako světlé proužky.

Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro DNA

Polyakrylamidové gely vznikají reakcí akrylamidu a bis-akrylamidu (N,N'-methylenbisakrylamidu), jejímž výsledkem je vysoce zesíťovaná gelová matrice. Akrylamidové gely mohou oddělit fragmenty DNA, které se liší i o 0,2 % délky. Zatímco proteiny musí být před separací na polyakrylamidu denaturovány pomocí SDS, molekuly DNA, které jsou negativně nabité, denaturovány být nemusí. Ve srovnání s agarózovými gely mohou polyakrylamidové gely pojmout větší množství vzorků a poskytují vysoké rozlišení fragmentů DNA.

Ačkoli se s oblibou používají prefabrikované gely PAGE pro DNA, náklady s tím spojené jsou vysoké, pokud je PAGE v laboratoři pravidelným postupem. Zkušený technik může připravit gely PAGE s malým úsilím za zlomek nákladů na prefabrikované gely. PAGE gely připravené ve vlastní režii poskytují lepší rozlišení a napomáhají dosažení konzistentních výsledků.

Protokol: Polyakrylamidová gelová elektroforéza DNA

Potřebný materiál a činidla

Vertikální elektroforézní komora se zdrojem napájení, skleněné destičky, distanční podložky a hřebeny

  • 30% roztok polyakrylamidu (filtrujte přes 0.45 mM filtr a uchovávejte ve tmě při teplotě 4 °C):

         29 g Acrylamide
         1 g Bis-acrylamide
         100 ml dvakrát destilované vody

  • 10% roztok persíranu amonného
  • TEMED
  • Elektroforézní pufr:

        1X TBE připravený v destilované vodě:
        89 mM Tris (pH 7.6)
        89 mM kyseliny borité
         2 mM EDTA

  • 5X pufr pro zatížení gelu:

         80% glycerol 75%
         Bromofenolová modř (B5525) 0.25%
         Xylencyanol (X4126) 0.25%
         1M Tris (pH 7.4) 10 mM
         5 M NaCl 10 mM
          0,5 M EDTA 10 mM
        10% SDS 0.1%

  • Ethidium bromid 0.5 µg/ml
  • Transiluminátor

    DŮLEŽITÉ: Akrylamid a bis-akrylamid jsou neurotoxické povahy. Všechny kroky by měly být prováděny v rukavicích bez prášku.

Postup

  • Skleněné destičky a distanční podložky jednotky pro odlévání gelu očistěte deionizovanou vodou a etanolem.
  • Sestavte destičky s distančními podložkami na stabilní povrch.
  • Připravte roztok gelu pomocí následujících objemů (pro 12 ml) v závislosti na požadovaném procentu gelu.

*TEMED musí být poslední přidanou složkou.

  • Nalijte roztok gelu do destiček sestavených s distančními podložkami. Okamžitě vložte hřeben a zajistěte, aby se v gelu nebo v blízkosti jamek nezachytily žádné vzduchové bubliny. Nechte gel ztuhnout asi 30-60 min při pokojové teplotě
    Polymerizovaný gel můžete zabalit do Saranovy fólie a uchovávat při teplotě 4 °C pro další použití.

  • Když jste připraveni provést elektroforézu, namontujte destičky s gelem do přístroje a naplňte komůrky 1X pufrem TBE. Doporučuje se provést předehru po dobu asi 10 min při 5 V/cm.
  •  Připravte si vzorky oligonukleotidů smícháním 1 µl vzorku s 5 µl 5X gelového nakládacího pufru. Vzorky opatrně naložte do jamek, aniž byste do nich vnesli vzduchové bubliny.
  • Velké gely mohou běžet ~70 V po dobu 14-16 h nebo 125-150 V po dobu 2-4 h nebo dokud se čelo barviva nepřiblíží ke dnu gelu. Dbejte na to, aby nedocházelo k nadměrnému zahřívání. Alternativně lze vzorky spustit při vyšším napětí v chladné místnosti.
  • Skleněné destičky otevřete špachtlí, oddělte horní skleněnou destičku. Obarvěte gel ještě připevněný ke spodní skleněné destičce roztokem ethidium bromidu 0,5 µG/ml po dobu 5 - 10 min.
  • Namočte gel na skleněné destičce do destilované vody na 10 - 30 min, abyste odstranili přebytečné barvivo a snížili zbarvení pozadí.
  • Zabalte gel a destičku do plastové fólie, převraťte na UV transiluminátor a pořiďte obraz gelu.
  • Vzorky se objeví jako světlé proužky.
  • Požadované proužky lze vyříznout jemným skalpelem a vhodným způsobem zpracovat pro získání DNA.

Jsou-li v oligonukleotidech obsaženy 35S nebo 33P nukleotidy, postupujte podle níže uvedeného postupu:

  • Namočte gel do 10% kyseliny octové na 15 min.
  • Gel osušte a zabalte do plastové fólie.
  • Gel sušte ve vakuové sušičce při 80 °C po dobu 20 min nebo déle.
  • Odstraňte plastový obal a vystavte gel rentgenovému filmu ve tmě.
Vertikální elektroforézní systém

Obrázek 3.Vertikální elektroforézní systém

Odkaz

1.
Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Související články
Související kategorie výrobků
Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.

Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.

Nemáte účet?