Protokol žíhání oligonukleotidů

• Zkratky
• Zařízení a potřeby pro žíhání DNA / RNA
• Metoda žíhání DNA / RNA
• Recepty na pufry pro žíhání DNA

Tento protokol slouží k žíhání dvou jednořetězcových oligonukleotidů s komplementárními sekvencemi (obrázek 1). Zahřátí a následné ochlazení usnadňuje hybridizaci.

Obrázek 1. Příklad reakce žíhání. Teplo "přeruší" všechny vodíkové vazby, a tím naruší sekundární strukturu v každém oligonukleotidu. Pomalé ochlazování pak usnadňuje hybridizaci, protože mezi komplementárními sekvencemi vznikají nové vodíkové vazby.

Definice / zkratky

EDTA: Kyselina ethylendiamintetraoctová

NaCl: Chlorid sodný

Trizma^® base:Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethan]

Oligo: Zkratka oligonukleotidu nebo oligomeru. Oligonukleotidy jsou krátké jednovláknové molekuly DNA nebo RNA, které je třeba žíhat (zahřát nebo roztavit), aby se mohly spojit a vytvořit dvojité vlákno s příslušným komplementárním vláknem DNA nebo RNA.

Žíhání DNA: Tato stránka pojednává o procesu žíhání všech oligonukleotidů. Někdy se žíhání označuje jako žíhání DNA, i když se tento proces používá i pro RNA. Žíhání je proces zahřívání a ochlazování dvou jednořetězcových oligonukleotidů s komplementárními sekvencemi. Zahřátím se přeruší všechny vodíkové vazby a ochlazením se mezi sekvencemi vytvoří nové vazby.

Zařízení a potřeby pro žíhání DNA / RNA

• Tepelný blok nebo termocykler
• 2 ml centrifugační zkumavky
• Pipetové špičky
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA (produkt č. 1), který je určen pro pipety s vysokým obsahem kyseliny. E9884)
• NaCl (produkt č. S3014)
• Trizma^® base (produkt č. 93362)
• Dva jednovláknové oligonukleotidy s komplementárními sekvencemi

Metoda žíhání DNA / RNA

Proces žíhání se dělí na dva hlavní kroky:

Rozpouštění oligonukleotidů

Ačkoli se každý oligonukleotid dodává v odměřeném množství, pro dosažení nejlepších výsledků jej ověřte spektrofotometrem, abyste se ujistili, že je do reakce přidáno stejné množství každého oligonukleotidu.

• Rozpusťte každý oligonukleotid v takovém objemu žíhacího pufru (viz recepty na pufry níže), aby měl každý z nich stejnou koncentraci.
• Koncentrace každého oligonukleotidu musí být 2× vyšší než požadovaná koncentrace duplexního oligonukleotidu.

Příklad

Požadovaná koncentrace duplexního oligonukleotidu je 50 µM.

1. Oligonukleotid 1: dodán s OD 10,55 (312.6 µg, 49,9 nmol); naměřené množství OD ověřte spektrofotometrem.
2. Oligonukleotid 2: dodán s 9,04 OD (279,7 µg, 45,9 nmol); naměřené množství OD ověřte spektrofotometrem.
3. Každý zásobní roztok oligonukleotidu musí mít 2× vyšší koncentraci než požadovaný duplexní oligonukleotid, tj. každý zásobní roztok musí mít 100 µM.
   1. Pro oligonukleotid 1 přidejte 49 µM.9 x 10 = 499 µl žíhacího pufru pro vytvoření 100 µM zásobního roztoku.
   2. Pro oligonukleotid 2 přidejte 45,9 x 10 = 459 µl žíhacího pufru pro vytvoření 100 µM zásobního roztoku.

*Tento výpočet je zkratka, která funguje pouze při vytváření 100 µM roztoků a je zde použita pouze pro příklad. Další informace o výpočtu různých koncentrací oligonukleotidů naleznete v Handling Guidelines & Stability.

Žíhání oligonukleotidů

Tepelný blok

1. Smíchejte stejné objemy ekvimolárních oligonukleotidů v mikrozkumavce.
2. Inkubujte mikrozkumavku při teplotě 95 °C po dobu 5 min.
3. Nechejte mikrozkumavku pomalu vychladnout na pokojovou teplotu (<60 min).

Termocykler

Ačkoli funguje i tepelný blok, termocykler umožňuje konzistentnější postup.

1. Smíchejte stejné objemy ekvimolárních oligonukleotidů ve zkumavce PCR.
2. Použijte následující tepelný profil:
   1. Zahřejte na 95 °C a udržujte teplotu po dobu 2 min.
      
   2. Chlaďte na 25 °C po dobu 45 min.
      
   3. Chlaďte na 4 °C pro dočasné skladování.
3. Krátce odstřeďte zkumavku PCR, aby se z víčka odvedla veškerá vlhkost.

Po nasazení tepelného bloku nebo termocykléru je nyní duplexní oligonukleotid připraven k použití nebo uskladnění. Další informace o skladování oligonukleotidů naleznete v Pokyny pro manipulaci & stabilitu.

Recepty pufrů pro žíhání DNA

Všechny pufry připravujte s vodou Milli-Q^® .

Složení pufru na žíhání (1X)

• 10 mM Tris, pH 7,5 - 8.0
• 50 mM NaCl
• 1 mM EDTA

Složení ligázového pufru (1X)

Tento pufr se obvykle používá s T4 DNA ligázou.

• 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
• 10 mM MgCl₂
• 1 mM ATP
• 10 mM DTT

Složení kinázového pufru (1X)

Tento pufr se obvykle používá s polynukleotidovou kinázou T4.

• 70 mM Tris-HCl, pH 7,6
• 10 mM MgCl₂
• 5 mM DTT