Výběr rekombinantů

• Modrá bílá projekce
• Minipreparáty DNA
• Screening restrikční digescí
• Screening pomocí PCR
• Potvrzení velikosti řezaných plazmidů pomocí elektroforézy v agarózovém gelu
  
• Maxipreps DNA
• Precipitace DNA
• Ošetření RNázou
• Ošetření RNázy
Čištění DNA

Screening modrobílých kolonií

Screening modrobílých kolonií je strategie pro rychlé a snadné rozlišení rekombinantních a nerekombinantních kolonií. Vyžaduje speciální vektor a speciální kmen E. coli. Je obzvláště užitečná při složitých klonovacích strategiích, jako je klonování s tupým koncem nebo příprava knihovny DNA. K přípravě činidel pro provedení screeningu lze buď použít níže uvedený protokol, nebo si můžete zakoupit k použití připravené modré bílé screeningové činidlo  (katalogové  číslo. B2928).

Jak funguje modrobílý screening

První gen v E. coli lac operonu je lacZ, který kóduje β-galaktosidázu (β-gal). Aktivní forma β-gal je tetramer a hydrolyzuje laktózu na glukózu a galaktózu. Vypuštění aminokyselin 11-41 β-gal (tzv. mutace lacZΔM15) znamená, že enzym není schopen tvořit tetramer a je nefunkční (Langley et al. 1975). Bylo zjištěno, že dodání aminokyselin 1-59 (α-peptidu) β-galu trans (odděleně) umožňuje zkrácenému β-galu tvořit tetramery a opět fungovat (Ullmann et al. 1967; Langley et al. 1975). Záchrana β-galu dodáním α-peptidu tímto způsobem byla označena jako α-komplementace. Později si Vieira a jeho kolegové (Vieira & Messing 1982) uvědomili, že α-komplementaci lze použít ke screeningu kolonií E. coli na přítomnost inzertů. Klonovali kódující oblast α-peptidu do plazmidu pUC a poté do středu této oblasti zavedli vícenásobné klonovací místo (MCS). Když se do MCS liguje kousek DNA, naruší se α-peptid, čímž se β-gal stane nefunkčním.

5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galaktopyranosid (x-gal) je bezbarvý analog laktózy. Když β-galaktosidáza hydrolyzuje x-gal, vzniká modrý produkt (5,5'-dibromo-4,4'-dichlorindigo). Při modrobílém screeningu se kmen E. coli transformuje pomocí ligační reakce a rozprostře se na agarové plotny obsahující x-gal. Modře zbarvená kolonie značí, že α-peptid v plazmidu je neporušený (bez inzertů), zatímco bílá kolonie značí, že α-peptid je narušený (přítomnost inzertů).

Co budete potřebovat pro modrobílý screening

• Kompetentní buňky kmene E. coli  s mutací lacZΔM15. Common blue white compatible strains include all SIG10 (Catalog No. CMC0001), SIG10 F' (Catalog No. CMC0002) a SIG10 5α kompetitivní buňky (katalogové č.  CMC0007).
• Vektor s kódovací oblastí α-peptidu a MCS. Mezi běžné vektory kompatibilní s modrou bílou patří: pGEM-T, pBluescript, pUC18 a pUC19
• Vaše ligační reakce (tj. vámi zvolený insert do vektoru kompatibilního s modrou bílou, viz výše).
• Kontrolní plazmid (např. pBluescript).
• Antibiotikum pro výběr vektoru.
• X-gal 20 mg/ml. X-gal lze zakoupit hotový rozpuštěný nebo jako prášek (katalogové číslo  B4252). Může být rozpuštěn v DMSO  (katalogové číslo: DMSO). D8418) or DMF (Catalog No. D4551) v koncentraci 20 mg/ml. X-gal musí být skladován při -20 °C a chráněn před světlem (obalením zásobní nádoby fólií).

Jak připravit modrobílé screeningové destičky

1. Připravte si několik LB agarových destiček obsahujících vhodné antibiotikum pro výběr zvoleného plazmidu.
2. Na každou destičku, která bude použita pro modrobílý screening, naneste 100 μl 20 mg/ml zásobního x-galu a 100 μl 10 mM IPTG a před použitím nechte destičky zaschnout s mírně pootevřeným víčkem. To lze provést buď vedle bunsenova hořáku na stole, nebo v digestoři s laminárním prouděním. Při použití digestoře může dojít k vysušení destiček, pokud jsou ponechány příliš dlouho.

Bakteriální transformace

Transformujte své ligační reakce do kompetentních E. coli buněk jako obvykle. Transformační reakci rozetřete na desku s x-gal IPTG (připravenou podle výše uvedeného postupu). Inkubujte destičku přes noc při 37 °C. Jakmile kolonie narostou, lze desku inkubovat 1 hodinu při 4 °C. To pomůže rozvinout modré zbarvení, které usnadní rozeznání negativních kolonií.

Je dobré zahrnout kontrolu. Transformujte alikvotní část E. coli s intaktním plazmidem obsahujícím α-peptid (například pBluescript). Všechny kolonie na této kontrolní destičce by měly být modré. Pokud tomu tak není, je možné, že x-gal nebyl rozprostřen rovnoměrně nebo že antibiotikum nepůsobí správně.

Poznámka: Tato obrazovka neposkytuje žádné informace o směru vložení, pouze o jeho přítomnosti či nepřítomnosti. Pokud je insert poměrně krátký a zachovává rámec α-peptidu, je možné (ale nepravděpodobné), že vytvoří funkční α-peptidovou fúzi, která dává modré kolonie, i když je tam insert (falešně negativní). Tyto kolonie však budou pravděpodobně světleji modré než pravé negativní. Je také možné (ale opět nepravděpodobné), že získáte bílou kolonii bez inzertu (falešně pozitivní). To může být důsledkem nukleázové degradace linearizovaného vektoru, která narušila α-peptid před opětovnou ligací. Proto je vždy dobré zkontrolovat insert také sekvenováním.^1,2,3

Protokol miniprepování DNA

Schopnost pracovat s DNA závisí na schopnosti izolovat ji z bakterií. Množství DNA, které je potřebné pro analýzu, určuje použitou techniku přípravy. Pro malá množství DNA (<5µg) se provádí miniprep, který obvykle poskytuje dostatek DNA pro analýzu. Pokud je zapotřebí větší množství DNA, lze provést maxiprepu, a pokud je zapotřebí ještě větší množství DNA, lze použít Mega nebo Giga prep.

Miniprep se nejčastěji používá ke zjištění, zda bakteriální klon obsahuje správný kus rekombinantní DNA. Po výběru kolonií (obvykle 5-15) a pěstování každé z nich v 3-5 ml média LB přes noc se bakterie peletují a poté lyzují. Genom bakterií je připoután k vnitřnímu povrchu plazmatické membrány a jako takový zůstává během extrakce s membránovou částí buňky. Malé plazmidy takto připoutány nejsou a lze je snadno izolovat z buněčných zbytků.

Mnoho laboratoří používá soupravy pro miniprepaci na spinových kolonách, jako jsou GenElute™ Plasmid Mini Prep Kit (katalogové číslo:

Plasmid Mini Prep Kit (katalogové číslo:

Plasmid Mini Prep Kit ). PLN70), nebo GenElute Five Minute Plasmid Mini Prep Kit (kat. č. 2), nebo GenElute Five Minute Plasmid Mini Prep Kit (kat. č. 2). PFM50) pro screening, ale tento protokol lze použít, pokud se rozhodnete nepoužít soupravu. Jedná se o rychlý a levný rutinní postup, který je založen na použití poměrně standardních chemikálií, vodní lázně, pipet, eppendorfových zkumavek a mikrocentrifugy. DNA, kterou produkuje, však může mít poněkud nižší kvalitu a množství než ekvivalentní DNA izolovaná pomocí soupravy se spinovou kolonou. Pro diagnostické klonování by to však neměl být problém.

Reagencie pro protokol miniprep DNA

• TES pufr (10 mM Tris-HCl (katalogové č. 2), který se používá pro přípravu pufru. 933622) pH 8.0, 5 mM EDTA (katalogové č. E6758), 250 mM sukróza (kat. č. S7903), sterilizováno filtrem)
• Lysozym (kat. č. L3790) uchovávaný v koncentraci 10 mg/ml ve vodě
• 5M NaClO4 (katalogové číslo. 410241)
• Isopropanol (Katal. č. I9516)
• TE Buffer (10mM Tris-HCl pH 8.0, 0,1mM EDTA) (katalogové č. T9285)
• Protokol minipreplikace DNA

Protokol

1. Začněte s čerstvou noční tekutou kulturou (Jedna kolonie odebraná a naočkovaná do 3 ml LB média předchozího večera).
2. Přidejte přibližně 1,5 ml každé kultury do eppendorfské zkumavky. Očíslujte eppendorfky podle čísel napsaných na zkumavkách s kulturami.
3. Centrifugujte zkumavky 1 minutu při maximální rychlosti a poté supernatant vyhoďte. Ujistěte se, že s bakteriálními peletami zůstalo pouze nepatrné množství LB média.
4. Znovu suspendujte pelety ve 150 µl TES pipetováním roztoku 200µl pipetou nahoru a dolů v blízkosti pelet (systematicky přejíždějte z jedné strany pelet na druhou, dokud nezůstane nic přilepeného ke stěně)
5. Přidejte roztok do zkumavek s bakteriemi, které se nacházejí na stěně./li>
6. Rychle přidejte 20 µl roztoku lysozymu (10 mg/ml v destilované vodě, obvykle se uchovává jako malá zásoba zmrazená při -20).
7. Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě.
8. Pipetou rychle přidejte 300 µl destilované vody k suspenzi, měla by se promíchat, zatímco je voda stříkána do zkumavky. Zkumavkami poté netřepejte. To by mělo být provedeno co nejrychleji a zkumavky se ihned umístí do tepelného bloku při teplotě 73 °C.
9. Inkubujte 15 minut.
10. Centrifugujte při maximálních otáčkách (13000 ot./min.) po dobu 15 minut. Někdy je peleta příliš velká (více pelety než supernatantu), pokud ano, pak odstřeďujte dalších 15 minut, buďte trpěliví, nakonec se peleta zmenší. Když je peleta velká, obvykle byla kultura příliš mladá (méně než 12 hodin stará).
    
    Supernatant přelijte do jiné eppendorfky (nezapomeňte na číslování). Přidejte 5M NaClO4 (přibližně 10 % objemu supernatantu, obvykle 10 % z 300 µl. Pokud je v některých zkumavkách méně supernatantu, přidejte do nich trochu TE, aby vypadaly jako většina). Uzavřete víčka a promíchejte protřepáním zkumavek. To lze provést buď ve stojanu pomocí víčka, aby zkumavky nevypadly, nebo protřepáním zkumavek jednotlivě.
11. Přidejte 400 µl isopropanolu, protřepejte jako předtím a odstřeďujte 15 minut při maximální rychlosti.
12. Odstraňte kapalinu a odstřeďujte ještě jednou 2 minuty. Odstraňte poslední kousek kapaliny pipetou o objemu 200 µl.
13. Sušte 15 minut v místnosti s teplotou 37 °C nebo v inkubátoru s otevřenými víčky.
14. Přidejte 50 µl TE a dejte na 5 minut na třepačku, poté DNA uložte nebo přejděte k protokolu pro screening kolonií.

Pro většinu studií in vitro v kultuře savců je zapotřebí více DNA, než se izoluje při miniprepu. Obvykle lze po identifikaci správného klonu DNA znovu zavést do bakterií a izolovat ji pomocí protokolu maxiprep. Je také možné ponechat si malou část každé z kultur, které byly použity v miniprepu, a pak přes noc pěstovat kulturu obsahující správný klon. Tím se ušetří čas, protože není nutné znovu transformovat bakterie a vybírat kolonie.

Screening pomocí restrikční digesce

Provádí se restrikční digesce, aby se zjistilo, zda vybraný klon obsahuje insert. Toto trávení je určeno jako kontrola kvality nebo k testování různých rekombinantů klonů a vyžaduje pouze malé množství plazmidu, který se standardní dobu (1 hodinu) tráví nadměrným množstvím enzymu. Celá reakce je určena k nanesení na agarózový gel. Není třeba provádět časový průběh jako u preparativního trávení.

Obvykle stačí 200 ng plazmidu a 1 jednotka enzymu v celkovém objemu reakce 10 µl. Nezapomeňte, že větší plazmidy mohou vyžadovat použití o něco většího množství DNA, pokud vystřihujete malé fragmenty. 200ng 3 kb plazmidu představuje 5krát více kopií než 15 kb plazmidu, a proto je kopií všech fragmentů, které vystřihnete, 5krát méně.

Pokud plazmid nepochází z relativně čisté maxiprep nebo ze soupravy pro miniprep na bázi křemičité pryskyřice, možná budete chtít použít více enzymu. Pokud je DNA připravena pomocí protokolu miniprep na této webové stránce, možná budete chtít zdvojnásobit nebo ztrojnásobit množství enzymu. Mezi běžně používané enzymy patří EcoR I (katalogové číslo:  -). R6265), BamH I (Catalog No. R0260), a Hind III (kat. č. R1137).

Reagencie pro čistý plazmid s 1 µg/µl

• 0.2-0,5 µl plazmidu
  
• 1 µl 10x restrikčního pufru
  
• 0.1-0,3 µl restrikčního enzymu 1
  
• 0,1-0.3 µl restrikčního enzymu 2 (volitelně)
  
• Přidejte až 10 µl s TE (kat. č. T9285) nebo vodou bez nukleáz (katalogové číslo: T9285)), nebo vodou bez nukleáz (katalogové číslo: T9285)). W4502)

Reagencie pro minipreparát plazmidu extrahovaného fenol-chloroformem (koncentrace DNA je mnohem nižší a obvykle neznámá)

• 3 µl plazmidu
  
• 1 µl 10x restrikčního pufru
  
• 0.1-0,3 µL Restrikční enzym 1
  
• 0,1-0.3 µL Restrikční enzym 2 (volitelně)
  
• Přidejte až 10 µL TE nebo vody

Protokol

1. Vypočítejte celkový počet vzorků, které máte prověřit, a poté přidejte jeden (n+1).
2. Připravte hlavní směs podle výše uvedených pokynů se vším kromě DNA, která se má screenovat. Pokud tedy máte deset vzorků, použijte 11 µl 10x restrikčního pufru, 1,1 µl enzymu a 95,7 µl vody.
3. Přidejte alikvotní část (minus množství DNA) mastermixu k počtu zkumavek, pro které máte vzorky. V tomto případě 10.
4. Přidejte DNA a promíchejte špičkou, abyste se ujistili, že se tráví.
5. Inkubujte 1 hodinu při 37 °C
6. Přidejte 1 µl nakládacího barviva a naložte na agarózový gel.

Poznámka: Některé enzymy reagují při teplotách vyšších nebo nižších než 37 °C. Zkontrolujte si to před nastavením reakce.

Screening kolonií pomocí PCR

Pro zjištění, které bakterie mají správnou rekombinantní DNA, je možné provést screening kolonií z agarové plotny pomocí metody PCR, aniž by bylo nutné je pěstovat přes noc. Jednou z metod je jednoduše se dotknout kolonie sterilním hrotem, pak hrot krátce ponořit do směsi PCR ve zkumavce PCR a poté stejný hrot ponořit do některého média a pěstovat je přes noc. Obvykle tento postup účinně funguje pouze v případě, že máte k dispozici relativně malou oblast, kterou je třeba amplifikovat (<500bp) pro detekci vašeho rekombinantního plazmidu, a spoléhá se na to, že ve fázi amplifikace při 98 ºC dojde k lýze bakterií, aby se uvolnila DNA. Chcete-li zajistit, aby E.coli byly před provedením amplifikace PCR účinně lyzovány, lze jako spolehlivější alternativu použít níže uvedený protokol.

1. Připravte 5 mg/ml zásobního roztoku Proteinázy K rozpuštěním 25 mg PCR třídy Proteinázy K  (katalogové číslo:

   Proteinase K 

2.  P2308) v 5 ml T0.1E (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Uchovávejte v alikvotech při -20 °C.
3. Pro každý vzorek připravte 25 µl lyzačního roztoku smícháním 1 µl zásobního roztoku 5 mg/ml Proteinázy K a 24 µl T0.1E v eppendorfské zkumavce
4. Vyberte kolonie pomocí sterilní špičky pipety.
   
5. Nasaďte část buněk na označenou LB destičku (s příslušným antibiotikem).
   
6. Zbylé buňky nasypte do 25 µl alikvotu lyzačního roztoku.
   
7. Inkubujte označenou destičku přes noc při 37 ºC, aby se obnovily kolonie.
8. Začněte lýzu buněk inkubací vzorků při 55 ºC po dobu 15 min.
   
9. Inkubujte vzorky při 80 ºC po dobu 15 min.
   
10. Zchlaďte vzorky na ledu.
    
11. Krátce promíchejte a odstřeďte.
12. V reakci PCR použijte 1 µl lyzátu.

Protokol Maxipreps

Podrobněji viz níže.Potřebná činidla

• TE 50/1 pufr (50mM Tris-HCL (kat. č. 1), který se používá k přípravě vzorků pro analýzu DNA, a který se používá k přípravě vzorků pro analýzu DNA. 93362) pH 8.0, 1mM EDTA (katalogové číslo  E6758) pH 8.0)
• Lysozym (Katalogové číslo: E757 ) L6876) v koncentraci 10 mg/ml ve vodě.
• 0,5M EDTA pH 8.0
• Ribonukleáza A (katalogové č. R4642) roztok v koncentraci 20 mg/ml v destilované vodě a uchovává se v 50µl alikvotech při -20 °C.
• 10% Triton X 100 ve vodě
• Equilibrovaný fenol (katalogové číslo: Triton X 100) v roztoku o koncentraci 1,5 ml.  P4557) (pH 8,0 s 0,1 % 8-hydroxychinolinu)
• 5M NaClO₄ (katalogové č. 410241)
• Izopropanol (Katal. č. I9516)
• TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA pH 8.0)
• SS34 Sorvall 50ml zkumavky a rotor nebo podobné
• 30ml zkumavky Corex a rotor HB4 nebo podobné

Potenciální nebezpečí: Fenol je velmi nebezpečný a při kontaktu s ním okamžitě způsobuje popáleniny kůže. Je toxický při kontaktu, vdechnutí i požití. Před použitím jakýchkoli nebezpečných chemických látek si přečtěte bezpečnostní list a porozumějte mu.

Poznámka:  Zavázali jsme se přinášet vám ekologičtější alternativní výrobky, které dodržují jednu nebo více z 12 zásad ekologičtější chemie. Přípravné soupravy GenElute™ Maxi byly navrženy pro bezpečnější chemii. Místo provádění fenol-chloroformových extrakcí DNA zvažte použití některé z těchto souprav.

Před zahájením si přečtěte protokol a ujistěte se, že máte připraveny všechny zásobní roztoky. Roztok lysozymu se obvykle připravuje v průběhu centrifugace. Zbytek musí být připraven před zahájením.

1. Předkulturu z 3 ml LB média připravíte hned ráno odebráním jedné kolonie z čerstvé agarové plotny (ideálně rozetřené předchozí noc).
2. Po 3 hodinách by měla být předkultura mírně zakalená, naočkujte 800 ml LB média předehřátého na 37 °C (500násobné ředění) a nechte růst přes noc (24 hodin). Kratší inkubace může způsobit problémy s nadbytkem proteinů a RNA v buněčném lyzátu.
3. Kulturu odstřeďte pomocí dostupné infrastruktury (např. 60 minut, 3699 ot./min.) a opatrně odstraňte supernatant. Dobře fungují 250ml polypropylenové zkumavky s kónickým dnem. Supernatant bude stále obsahovat E.coli, takže jej nevyklopte rovnou do dřezu.
4. Zkumavky obsahující buněčné pelety dejte na led a pelety znovu rozpusťte v 8 ml ledově studené TE 50/1 (viz výše). Pelety musí být zcela resuspendovány občasným vířením a umístěním zpět na led, což nějakou dobu trvá (5 minut). Přeneste buněčnou suspenzi 10ml pipetou do čistých 50ml zkumavek SS34, které již stojí na ledu. Veškerá další manipulace se bude provádět na ledu! V tomto okamžiku je vhodné udělat si v případě potřeby přestávku.
5. Rychle přidejte 2,5 ml čerstvě připraveného roztoku lysozymu (10 mg/ml) do všech zkumavek, zkumavky uzavřete a rychle je otočte dnem vzhůru a zpět alespoň 10krát (nejlépe všechny zkumavky najednou. Suspenze by měla být mírně viskózní. Zkumavkami netřepejte, pouze je otočte. Třesením se genomová DNA střihne a kontaminuje vaši plazmidovou DNA.
6. Inkubujte 5 minut na ledu.
7. Odšroubujte lahvičky a od této chvíle si pamatujte, které víčko patří ke které zkumavce (velmi důležité, protože roztok je viskózní a značná část se přilepí na víčko). Rychle přidejte 2,0 ml 0,5M EDTA pH 8,0, zkumavky uzavřete a znovu je otočte jako předtím. Opět s nimi silně netřepejte! Suspenze bude viskóznější.
8. Inkubujte dalších 5 minut na ledu.
9. Smíchejte 50 µl roztoku ribonukleázy A (viz výše) se 150 µl 10% roztoku Tritonu X-100 a doplňte do 1 ml pomocí TE 50/1. Přidejte tuto směs do zkumavek. Poté zkumavky uzavřete a otočte je jako předtím (bez protřepávání). Suspenze bude ještě viskóznější.
10. Inkubujte 30 minut na ledu, aniž byste se jich znovu dotkli. Smyslem je nechat detergent provést zbytek buněčné lýzy velmi šetrným způsobem na ledu.
11. Centrifugujte při 18 000 otáčkách za minutu v rotoru Sorvall SS34 nebo podobném po dobu 60 minut. Měli byste získat pěknou peletu, ale někdy může být peleta velká s velmi malým množstvím supernatantu. To se obvykle stává, když je vaše bakteriální kultura příliš mladá. V takovém případě odstřeďování zopakujte, mělo by to pomoci.
12. Přeneste čirý supernatant do čisté zkumavky Falcon. Nyní je možné postup přerušit na delší dobu zmrazením získaného supernatantu při -20 °C. Je také možné udělat polední přestávku a supernatant ponechat na ledu.
13. Přidejte 20 ml ekvilibrovaného fenolu (viz výše) a 1 minutu intenzivně protřepávejte, 20 minut roztočte maximální rychlostí ve výkyvném rotoru.
14. Pomalu obnovte vodnou fázi (horní) a ujistěte se, že jste ponechali interfázi ve zkumavce. Přeneste horní fázi do nové zkumavky a přidejte 20 ml chloroformu, opět protřepejte jako předtím a spinujte jako předtím po dobu 5 minut.
15. Pomalu obnovte vodnou fázi (tentokrát je snazší vyhnout se interfázi), přeneste do 30ml zkumavky Corex (mezi 10 a 15ml, objemy je třeba vyrovnat přidáním TE 50/1), přidejte 1ml 5M NaClO4 (10% objemu vody), promíchejte a přidejte 8ml isopropanolu (80% objemu vody).
16. Zkumavku uzavřete parafilmem a několikrát ji otočte, aby se vše promíchalo. Poté roztočte v rotoru HB4 při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut.
17. Supernatant vylijte, peletu vysušte ponecháním otevřeného víčka na stole nebo při 37 °C.
18. Znovu rozpusťte v 500 µl TE a přeneste do sterilní eppendorfky. Vyvarujte se přílišného vysušení pelety.
19. Uchovejte při 4 °C.
20. Bude třeba zkontrolovat DNA na gelu, abyste posoudili množství RNA , obvykle je nutné v tomto okamžiku provést druhé ošetření RNázou.

Poznámka: Vámi izolovaná plazmidová DNA je připravena k transfekci do hmyzích nebo savčích buněk pomocí standardních transfekčních činidel, jako je Escort™ IV (produkt č. 1), a k transfekci do hmyzích nebo savčích buněk. L3287), univerzálního transfekčního činidla (č. výrobku T0956) nebo sady pro transfekci fosforečnanem vápenatým (č. výrobku CAPHOS).

Protokol srážení DNA

Srážení DNA může být trefa do černého. Někdy skončíte se stejným množstvím a její větší koncentrací a čistotou, jindy s ničím. Pokud to uděláte správně, pak by to mělo fungovat dobře, ale práce s nízkými koncentracemi DNA (<20ng/μl) ve velkých objemech může být složitá.

Materiály

• 3M pufr s octanem sodným, pH 5,2 (ideálně při 4 °C)
• studený 100% etanol (ideálně při -20 °C) (výrobek č. 57023)
• Studený 70% etanol ve sterilním dH₂O (ideálně při -20 °C)
• Vzorky DNA
• Mikrocentrifuga (ideálně chlazená centrifuga nebo centrifuga uchovávaná v chladírně). Odstřeďujte s vypnutou brzdou.

Protokol

1. Přeneste DNA do nádoby, ve které zabírá méně než čtvrtinu celkového objemu (např.5ml zkumavka by neměla obsahovat více než 375 µl roztoku DNA).
2. Přidejte jednu desetinu objemu DNA do pufru octanu sodného, aby se vyrovnaly koncentrace iontů.
3. Přidejte 2 až 3 objemy studeného 100% ethanolu a umístěte vzorek na nejméně jednu hodinu do mrazničky o teplotě -20 °C.
4. Centrifugujte vzorek 15 minut při nejvyšších otáčkách (12-13 000 ot./min.) v mikrocentrifuze o teplotě 4 °C.
5. Odstraňte co nejvíce supernatantu buď 1ml pipetou, nebo skleněnou kapilární zkumavkou. Dávejte pozor, abyste nenarušili pelety. Pokud se vám podaří odstranit veškerou tekutinu, přejděte ke kroku 6. Pokud ne, krátce znovu odstřeďte a poté odstraňte zbytek pipetou o objemu 200 µl.
6. Přidejte 250 µl studeného 70% ethanolu.
7. Centrifugujte 5 minut v centrifuze o teplotě 4 °C při maximální rychlosti.
8. Odstraňte supernatant 200 µl pipetou; odpařte zbývající ethanol ve vodní lázni o teplotě 37 °C. Nedělejte to příliš dlouho, protože přesušení pelety může ztížit její resuspenzi.
9. Znovu suspendujte peletu v požadovaném objemu vody nebo TE pufru.

Tip 1: Provedení precipitace při 4 °C není nezbytně nutné pro její fungování, ale může zvýšit účinnost, zejména u vzorků s nízkou koncentrací (<20ng/ µl).

Tip 2: Srážení DNA lze použít k vyčištění vzorku DNA, nikoli pouze k jeho zakoncentrování. Odstraní z roztoku veškeré kontaminující soli.

Úprava a odstranění RNA pomocí RNázy

Reagents

• TE (Catalog No. T9285)
• RNáza A (Katal. č. R4642) v koncentraci 20 mg/ml ve vodě
• Fenol (kat. č. P4557)
• Chloroform (Katal. č. 288306)
• 5M NaClO₄ (Catalog No. 410241)
• Isopropanol (Katal. č. I9516)

Potenciální nebezpečí: Fenol je velmi nebezpečný a při kontaktu s pokožkou způsobuje okamžité popáleniny. Je toxický při styku, vdechnutí i požití. Před použitím jakýchkoli nebezpečných chemických látek si přečtěte bezpečnostní list a porozumějte mu.

Potenciální nebezpečí: Chloroform je toxický při vdechnutí, orální konzumaci a styku s kůží. Před použitím jakýchkoli nebezpečných chemikálií si přečtěte bezpečnostní list a porozumějte mu.

1. Zřeďte maxiprep na 5 ml s TE v 50ml zkumavce Falcon.
2. Přidejte 50 μl RNázy A (20 mg/ml) a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 min.
3. Přidejte 5ml fenolu a 1 minutu intenzivně protřepávejte, 15 minut spinujte maximální rychlostí ve výkyvném rotoru.
4. Pomalu obnovte vodnou fázi (horní) a ujistěte se, že jste ve zkumavce ponechali interfázi. Přeneste do nové zkumavky a přidejte 5 ml chloroformu, opět protřepejte jako předtím a spinujte jako předtím po dobu 5 minut.
5. Pomalu obnovte vodnou fázi (tentokrát je snazší vyhnout se interfázi), přeneste do 15ml zkumavky Corex (cca 5 ml), přidejte 500 μl 5M NaClO4 (10 % objemu vody), promíchejte a přidejte 4 ml isopropanolu (80 % objemu vody). Zkumavku uzavřete parafilmem a několikrát s ní otočte, aby se vše promíchalo.
6. Poté roztočte v rotoru HB4 při 10 000 ot/min po dobu 15 minut.
7. Supernatant vylijte, pelet vysušte, resuspendujte v 500 μl TE (10mM Tris-HCl pH 8.0; 0,1 mM EDTA pH 8,0) a přeneste do sterilní eppendorfské zkumavky.
8. Uchovejte při 4 °C.
9. Zkontrolujte DNA na agarózovém gelu, zda většina RNA zmizela. Stanovte koncentraci a čistotu DNA spektrofotometricky (v tomto bodě je užitečným nástrojem nanodrop).

Čištění DNA

Reakční podmínky mnoha postupů rekombinantní DNA jsou neslučitelné, například mezi restrikčním štěpením a ligací. To vyžaduje, abyste odstranili enzym a pufr z předchozího kroku, abyste mohli zahájit další krok. To lze provést různými metodami, včetně použití souprav pro extrakci a purifikaci, fenol-chloroformové extrakce nebo použití souprav pro miniprepaci upravenou metodou. Pravděpodobně nejdůležitějším hlediskem pro většinu laboratoří jsou náklady. Nejlevnější je fenol-chloroformová extrakce a nejdražší je použití miniprepovací kolony. Z hlediska bezpečnosti je to však přesný opak!

Pro čištění reakcí existuje mnoho specializovaných souprav. Mnoho lidí používá soupravy pro čištění PCR , jako je například GenElute™ PCR Cleanup Kit  (katalogové číslo: 2). NA1020) pro čištění enzymatických reakcí, ale zkontrolujte si velikostní vylučovací limity na koloně a vazebné kapacity. Některé soupravy pro PCR nevážou DNA <200bp nebo >4-5kb.

Níže je uvedena metoda použití fenolu a chloroformu k extrakci DNA z enzymatické reakce, ale před pokračováním si přečtěte SDS. Kroky k získání vodné horní fáze jsou poněkud složité, možná nejobtížnější ze všech technik rekombinantní DNA, a vyplatí se je natrénovat na falešných vzorcích (pouze TE), než začnete. Třesoucí se ruce nepomohou.

Reagencie

• TE (10mM Tris-HCl pH 8,0, 0.1mM EDTA)
• Ekvilibrovaný fenol
• Chroloform
• 5M chlornan sodný (5M NaClO₄)

Potenciální nebezpečí: Fenol je velmi nebezpečný a při kontaktu s ním dochází k okamžitému popálení kůže. Je toxický při styku, vdechnutí i požití. Před použitím jakýchkoli nebezpečných chemických látek si přečtěte bezpečnostní list a porozumějte mu.

Potenciální nebezpečí: Chloroform je toxický při vdechování, orální konzumaci a styku s kůží. Před použitím jakýchkoli nebezpečných chemických látek si přečtěte bezpečnostní list a porozumějte mu.

1. Vložte 50 μl "špinavé" DNA do 1,5ml eppendorfky.
2. Přidejte 50 μl TE.
3. Přidejte 50 μl ekvilibrovaného fenolu.
4. Vortexujte (vzorek by měl být "mléčný"). Cílem je získat emulzi mezi fenolem a vodnou fází. Dbejte na to, aby bylo víčko řádně uzavřeno. Proteiny budou migrovat do fenolové fáze, zatímco DNA zůstane ve vodné fázi.
5. Přidejte 100 μl chloroformu a vortexujte. Dbejte na to, aby bylo víko řádně uzavřeno. Nyní, když jsou DNA a proteiny rozděleny, jde o to oddělit obě fáze.
6. Centrifugujte zkumavku 5 minut při maximální rychlosti (12-13000 ot./min) v mikrocentrifuze.
7. Znovu získáte horní (vodnou) fázi a přenesete ji do nové 1. zkumavky.5 ml zkumavky obsahující 100 μl chloroformu.
8. Virtualizujte a znovu odstřeďujte 2 minuty při maximálních otáčkách v mikrocentrifuze.
9. Znovu převeďte horní (vodnou) fázi do nové zkumavky o objemu 1.5 ml zkumavky a poté přidejte 10 μl 5M NaClO₄ a promíchejte.
10. Přidejte 110 μl isopropanolu, vortexujte a odstřeďujte 15 minut při maximálních otáčkách v mikrocentrifuze.
11. Supernatant opatrně zlikvidujte a znovu centrifugujte 1 minutu při maximálních otáčkách.
12. Na opačnou stranu pelety (která by měla být sotva viditelná) vložte jemnou špičku pipety nebo jemnou skleněnou pasteurovu pipetu a tekutinu odsajte. V odsávání pokračujte, i když je kapalina pryč, abyste odstranili veškerou kapalinu ze stěn zkumavky. Měli byste se také snažit posbírat všechny kapičky, které vidíte na stěnách zkumavky, pohybem pipety a využitím kapilárních sil. Důležité je, aby zůstala pouze suchá peleta.
13. Ponechte zkumavku otevřenou 1 minutu při pokojové teplotě a poté peletu resuspendujte ve vhodném objemu TE (přibližně 30-50 μl).
14. Udržujte zkumavku na ledu a občas ji promíchejte, trvá několik minut, než se všechen plazmid v peletu opět rozpustí.
15. Nyní můžete přejít k další manipulaci, například k ligaci.

Tip: Odstranění fenolového odpadu může být v mnoha laboratořích obtížné. V ideálním případě se obraťte na osobu odpovědnou za bezpečnost a likvidaci ve vaší budově a zeptejte se jí, co je třeba udělat, abyste vyhověli místním předpisům.

Odkazy

1. Langley KE, Villarejo MR, Fowler AV, Zamenhof PJ, Zabin I. 1975. Molecular basis of beta-galactosidase alpha-complementation.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72(4):1254-1257. https://doi.org/10.1073/pnas.72.4.1254

2. Ullmann A, Jacob F, Monod J. 1967. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the ?-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 24(2):339-343. https://doi.org/10.1016/0022-2836(67)90341-5

3. Vieira J, Messing J. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19(3):259-268. https://doi.org/10.1016/0378-1119(82)90015-4