Protokol PCR s koncovým bodem pro dlouhou a přesnou amplifikaci DNA

Přehled technologií
Vybavení
Reagenty
. Pohledy na analýzu
Postup
Odstraňování problémů
. Materiály
Reference

Přehled technologií

Proč používat polymerázy s vyšší věrností nebo procesivitou?

Mnoho dnešních technik vyžaduje delší amplifikaci a větší věrnost, než jakou může poskytnout standardní Taq DNA polymeráza. Aplikace, jako je analýza genomu, klonování, sekvenování, analýza mutací a exprese proteinů, vyžadují nejen PCR, ale i dlouhou, vysoce věrnou PCR. Standardní PCR s použitím Taq DNA polymerázy je obecně omezena na amplifikace do 5 kb. To je částečně způsobeno tím, že Taq DNA polymeráze chybí 3′→5′ exonukleáza nebo "proofreading" aktivita, která opravuje periodické chybné složení. Po chybné inkorporaci enzym buď pokračuje v inkorporaci nukleotidů, což způsobí procesní chybu, nebo dojde k terminální události a elongace se zastaví.

Dlouhé a přesné (LA) PCR se dosahuje kombinací vysoce procesní termostabilní polymerázy s druhou termostabilní polymerázou, která vykazuje 3′→5′ exonukleázu. Toto smíchání dramaticky zvyšuje délku amplifikace tím, že využívá korekturní polymerázu k opravě terminálních chybných spojení. Tato oprava umožňuje polymeráze pokračovat v prodlužování rostoucího vlákna DNA.

Směsi DNA polymerázy AccuTaq™ LA a KlenTaq^® LA kombinují vysoce kvalitní, vysoce procesní polymerázu s malým množstvím termostabilního korektorovacího enzymu. Výsledné směsi enzymů jsou schopny amplifikovat cílové DNA od 0,25 do 40 kb s až 6,5krát vyšší věrností než standardní Taq DNA polymeráza.

Vybavení

• pipety dávkující objemy od <1 do 200 μl
• stolní mikrocentrifuga
• termický cyklér
• zařízení pro elektroforézu
• UV transiluminátor
• svítidlo pro UV záření

Reagents

• Enzym a pufr, projděte si následující tabulku, abyste určili optimální činidla pro vaši aplikaci:

bez horkého startu				s Hot-startem
Čiré složení bez barviva	S červeným barvivem pro přímé zatížení gelů	Čiré složení bez barviva	S červeným barvivem pro přímé načítání na gely
AccuTaq™ LA DNA polymeráza	REDAccuTaq® LA DNA Polymeráza (D4812)	JumpStart™ AccuTaq™ LA DNA Polymeráza	JumpStart™ REDAccuTaq® LA DNA Polymerase (D1313)

• Sterilní filtrační hroty pipet
  
• Zkumavky pro PCR, vyberte jednu z následujících možností, aby odpovídaly požadovanému formátu:
  • Individual thin-walled 200 µL PCR tubes (Z374873 or P3114)
  • Individual thin-walled 650 µL PCR zkumavky (Z374873)
  • páskové zkumavky, 200uL (Z374962)
  • Tabulky
    • 96 jamkové destičky (Z374903)
    • Těsnění destiček
      • AlumaSeal^® 96 fólií (Z721549)
        
        
• dNTP mix, po 10 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP (D7295)
• Voda třídy PCR (W1754)
• DNA templát
• Primery zředěné na pracovní koncentraci (pro většinu testů postačí 10µM pracovní zásoby)
• ul>
• Objednejte si vlastní oligo zde
  

DNA marker, vyberte vhodný marker podle velikosti vašeho PCR amplikonu

Název produktu (Číslo výrobku)	DirectLoad™ 1 kb DNA Ladder (D3937)	DNA Ladder, Supercoiled (D5292)	DirectLoad™ Wide Range DNA Marker (D7058)
Rozsah velikosti	500bp -10 000bp	2 067bp - 16 210bp	50bp -10 000bp
Obrázek žebříčku	(0,75 % gelu)	(0.7% gel)	(0,75 % gelu)

Úvahy o analýze

Pokyny pro přípravu- Spolehlivá amplifikace dlouhých sekvencí DNA vyžaduje:

   1) účinnou denaturaci templátu DNA,
        nbsp;2) přiměřenou dobu prodlužování, aby vznikly velké produkty
   3) ochranu cílové DNA před poškozením depurinací.

Pro dosažení nejlepších výsledků optimalizujte reakci pomocí následujících parametrů:

• Termický cyklér
  • Pro vývoj parametrů cyklování byly použity cykléry Perkin-Elmer DNA Cyclers 480 a 9700. Lze použít i jiné typy termálních cyklérů, ale mohou vyžadovat další optimalizaci parametrů cyklování.
• Primer design
  • Primery jsou obvykle dlouhé 21 až 34 bází a jsou navrženy tak, aby obsah GC byl 45-60 %.
  • Optimálně by teploty tání přímého a zpětného primeru měly být v rozmezí 3 °C od sebe a TM primerů by se měla pohybovat mezi 65-72 °C.
  • Primery by neměly mít žádné vnitřní sekvence párování bází (tj, potenciální vlásenky) nebo komplementární oblasti o významné délce mezi oběma primery PCR.
• Templát
  • Neporušený, vysoce kvalitní templát je nezbytný pro spolehlivou amplifikaci větších fragmentů.
  • Přípravě a manipulaci s terčem DNA pro dlouhou PCR je třeba věnovat mimořádnou pozornost. Překrojená nebo poškozená DNA může sloužit jako potenciální primingové místo, což má za následek vysoké pozadí.
  • Vyhněte se zmrazování, případně zmrazujte pouze jednou, abyste minimalizovali poškození.
  • Depurinace během cyklování se minimalizuje použitím pufrů s pH vyšším než 9,0 při 25 °C. Toto vyšší pH omezuje možné poškození DNA při depurinaci.
• Koncentrace hořčíku
  • Může být nutná optimalizace koncentrace hořčíku. Obecně by se koncentrace hořčíku měla pohybovat mezi 1 a 5 mM.
• Cyklování
  • Efektivní denaturace se dosáhne použitím vyšších teplot po kratší dobu.
  • Teplota extenze by měla být omezena na 68 °C pro optimální výkon. Teploty vyšší než 68 °C mohou mít za následek snížení nebo absenci produktu. U cílů větších než 20 kb by doba extenze měla být delší než 20 minut.
  • Žíhání primerů a extenzi produktu lze také spojit do jednoho kroku, pokud jsou primery navrženy tak, aby jejich TM byla rovna nebo vyšší než 70 °C.
• Příprava pufru
  • Pufr AccuTaq LA 10X má poměrně vysoké pH a hořčík se může srážet jako hydroxid hořečnatý [Mg(OH)2]. Před použitím pufr rozmrazte při pokojové teplotě a poté jej vortexem znovu rozpusťte, aby se vysrážený Mg(OH)2 znovu rozpustil. Případně pufr zahřívejte při 37 °C po dobu 3 až 5 minut a poté jej promíchejte.
• Možnosti horkého startu
  • Hot- start dNTPs (DNTPCA1) lze použít v testovacích reakcích pro D8045 nebo D4812 přidání horkého startu

Použití REDAccuTaq-Vzhledem k tomu, že červený značkovač nemá žádný vliv na proces amplifikace, lze vzorek snadno reamplifikovat jako při "nested PCR". Přítomnost barviva rovněž nemá žádný vliv na automatické sekvenování DNA, ligaci, exonukleolytické štěpení produktů PCR a transformaci. Ačkoli mohou existovat výjimky, barvivo je obecně inertní při štěpení restrikčními enzymy. V případě potřeby lze barvivo z amplikonu odstranit běžnými purifikačními metodami.

Postup

Optimální podmínky pro PCR závisí na použitém systému. Následující protokol slouží pouze jako referenční.

1. Vložte do PCR vzorky. Do tenkostěnné 0,2 ml nebo 0,5 ml zkumavky pro PCR přidejte následující činidla:

Reagent	Konečná koncentrace	Objem
AccuTaq LA 10 x pufr (B0174)*	1x	5 µl
500 µM	2.5 µl
Template DNA	200-500 ng celkem**	- µl
Přední primer (10 µM)	0.4 µM	2 µl
Reverzní primer (10 µM)	0.4 µM	2 µl
Voda, PCR činidlo (W1754)	----	q.s.
Dlouhodobý a přesný PCR enzym (1 jednotka/µl)	0.05 jednotek/µl	2.5 µL
Celkový objem***		q. 50 µL

*Pufr je dodáván s enzymy (D8045, D4812, D5809 a D1313)
**Obvykle se jedná o množství komplexní cílové DNA (např. lidské genomové DNA) potřebné pro jednu reakci. Pro amplifikaci jednoduché cílové DNA, jako je lambda DNA, je zapotřebí méně DNA.
*** Konečný objem reakce PCR lze zmenšit na 20 µl úměrným snížením jednotlivých složek.

2. Objem reakce PCR se sníží na 20 µl. Nastavte druhou reakci bez templátové DNA, která bude sloužit jako kontrola bez templátu.

3. V případě, že se jedná o reakci bez templátové DNA, nastavte druhou reakci. Jemně promíchejte a krátce odstřeďte, aby se všechny složky shromáždily na dně zkumavky.

4. Reakce se rozdělí na dvě části. Přidejte 50 µl minerálního oleje do horní části každé zkumavky, abyste zabránili odpařování (volitelné, v závislosti na modelu termocykléru).

5. Přidejte 50 µl minerálního oleje do horní části zkumavky, abyste zabránili odpařování. Optimální parametry cyklování se liší podle složení PCR a termálního cykléru. Pro dosažení maximálního výtěžku a/nebo kvality produktu může být nutné optimalizovat parametry cyklování.

Typické parametry cyklování pro 20kb fragment genomové DNA

Počáteční denaturace	96 °C	30 s
Pro cyklus 1-30:
Denaturace	94 °C	5-15 s
Žíhání	62-65 °C	30 s
Roztahování	68 °C	20 -25 min
Konečné prodloužení	68 °C	30 min
Hold	4 °C

6. Vyhodnoťte amplifikovanou DNA přímým naložením 8-10 μl PCR reakce na 0,8 -1% agarózový gel a následným obarvením ethidium bromidem.⁶

Typické parametry cyklování pro 20kb fragment genomové DNA

Počáteční denaturace	96 °C	30 s
Pro cyklus 1-30:
Denaturace	94 °C	5-15 s
Žíhání	62-65 °C	30 s
Roztahování	68 °C	20 -25 min
Konečné prodloužení	68 °C	30 min
Hold	4 °C

7. Vyhodnoťte amplifikovanou DNA přímým naložením 8-10 μl PCR reakce na 0,8 -1% agarózový gel a následným obarvením ethidium bromidem.⁶
Poznámka: Při amplifikaci fragmentů menších než 20 kb lze dobu prodlužování zkrátit podle velikosti fragmentu. Obvykle pro fragment o velikosti 1 kb postačí doba prodlužování jedna minuta.

Průvodce řešením problémů

Problém	Možná příčina	Řešení<./th>
Není pozorován žádný produkt PCR	Složka PCR chybí nebo je degradovaná.	Vždy by měla být provedena pozitivní kontrola, aby bylo zajištěno, že komponenty fungují. Při sestavování reakcí se také doporučuje kontrolní seznam.
	Bylo provedeno příliš málo cyklů.	Zvýšit počet cyklů (vždy 3-5 dalších cyklů).
	Teplota žíhání je příliš vysoká.	Snižte žíhací teplotu po 2-4 °C.
	Primery nejsou navrženy optimálně.	Potvrdit přesnost sekvenčních informací. Pokud jsou primery kratší než 27 nukleotidů, zkuste primer prodloužit na 27-33 nukleotidů. Pokud má primer obsah GC menší než 45 %, zkuste znovu navrhnout primer s obsahem GC 45-60 %.
	Není dostatek templátu.	Poté, co zvýšení počtu cyklů nevedlo k úspěchu, zopakujte reakci s vyšší koncentrací templátu.
	Šablona je nekvalitní.	Vyhodnoťte integritu šablony pomocí gelové elektroforézy. Možná bude nutné přečistit templát metodami, které minimalizují střih a nicking.
	Teplota denaturace je příliš vysoká nebo příliš nízká.	Optimalizujte teplotu denaturace zvýšením nebo snížením teploty v krocích po 1 °C.
	Denaturační doba je příliš dlouhá nebo příliš krátká.	Optimalizujte denaturační dobu zvýšením nebo snížením v desetisekundových krocích.
	Doba prodlužování je příliš krátká.	Prodlužujte dobu prodlužování po 2minutových krocích, zejména u dlouhých šablon.
Není pozorován žádný produkt PCR (pokračování)	Reakce nemá dostatek enzymu.	Pro většinu aplikací stačí 1,0 µl (2,5 jednotky). Před zvýšením koncentrace enzymu se doporučuje optimalizovat parametry cyklu. Ve vzácných případech lze zvýšit výtěžky zvýšením koncentrace enzymu. Pokud je však množství enzymu vyšší než 2 µl (5 jednotek), mohou se objevit vyšší hladiny pozadí.
	Hladiny Mg2+ jsou suboptimální.	To je nepravděpodobné, pokud se použije 10x reakční pufr (s MgCl2) a koncentrace deoxynukleotidů nepřesáhne 0,6 mM každý (protože deoxynukleotidové trifosfáty mohou vázat Mg2+). Obvykle se MgCl2 optimalizuje v rozmezí 1 až 5 mM. Také EDTA přítomná ve vzorku v množství větším než 5 mM sníží účinnou koncentraci hořčíku.
	Koncentrace deoxynukleotidu je příliš nízká.	To je nepravděpodobné, pokud je konečná koncentrace každého deoxynukleotidu 0,5 mM. Tato koncentrace dNTP je vhodná pro širokou škálu aplikací. Pokud se dNTP připravují v laboratoři, ujistěte se, že konečná koncentrace každého deoxynukleotidu je 0,5 mM. Pokud se koncentrace dNTPs zvýší, bude třeba úměrně zvýšit koncentraci Mg2+
	Cílová šablona je složitá.	Ve většině případů jsou inherentně složité cíle způsobeny neobvykle vysokým obsahem GC a/nebo sekundární strukturou.
Jsou zde vícenásobné nebo rozmazané produkty	Teplota žíhání je příliš nízká.	Zvyšujte teplotu žíhání v krocích po 2-3 °C.
	Primery nejsou navrženy optimálně.	Potvrdit přesnost sekvenčních informací. Pokud jsou primery kratší než 27 nukleotidů, zkuste je prodloužit na 27-33 nukleotidů. Pokud má primer obsah GC menší než 45 %, zkuste znovu navrhnout primery s obsahem GC 45-60 %.
	Může být nutné provést PCR s dotykem.	"Touchdown" PCR výrazně zlepšuje specifičnost mnoha reakcí PCR v různých aplikacích. Touchdown PCR zahrnuje použití teploty žíhání/extenze, která je vyšší než TM primerů během počátečních cyklů PCR. Teplota žíhání/extenze se poté sníží na TM primerů pro zbývající cykly PCR. Změnu lze provést v jednom kroku nebo postupně v několika cyklech. 7
	Bylo provedeno příliš mnoho cyklů.	Nespecifické pásy lze odstranit snížením počtu cyklů.
	V reakční směsi je příliš mnoho enzymu.	Pro většinu aplikací stačí 1 µl (2,5 jednotky). Tato koncentrace však může být pro některé aplikace příliš vysoká. Doporučujeme nejprve optimalizovat parametry cyklu, jak je popsáno výše, a poté v případě potřeby postupně snižovat koncentraci enzymu, aby se určila optimální koncentrace.
Vyskytují se vícenásobné nebo rozmazané produkty (pokračování)	Koncentrace hořčíku je příliš vysoká.	Koncentrace MgCl2 by se měla optimalizovat. Obvykle je koncentrace MgCl2 optimální mezi 1 a 5 mM. Pokud je koncentrace dNTPs 0,5 mM, je velmi nepravděpodobné, že je koncentrace hořčíku příliš vysoká.
	Koncentrace templátu je příliš vysoká.	Snižte koncentraci templátu v reakci PCR.
	Koncentrace templátu je příliš nízká.	Přidejte další templát v krocích po 50 ng pro genomovou DNA nebo 1-2 ng pro virovou DNA.
Při použití enzymu JumpStart nedochází ke snížení nespecifických pásů PCR.	Afinita protilátky může být snížena složkami reakce nebo podmínkami.	Některá kosmetická rozpouštědla, rozpuštěné látky (např, soli) a extrémní hodnoty pH mohou snížit afinitu protilátky JumpStart Taq k polymeráze, a tím ohrozit její účinnost. Zkontrolujte reakční směs a podmínky a/nebo zkontrolujte systém pomocí manuální metody horkého startu.
	Primery nebyly vhodně navrženy.	Zkontrolujte systém pomocí manuální metody horkého startu. Pokud jsou výsledky podobné, zvyšujte teplotu žíhání v krocích po 2-3 °C, abyste zlepšili specifičnost vazby. Pokud zvýšení teploty sníží výtěžek specifického produktu pouze s malým snížením produktů vedlejších reakcí, může být nutné přepracovat návrh primerů.8
	Došlo ke křížové kontaminaci specifických a/nebo nespecifických produktů PCR.	Přijměte zvláštní opatření, abyste zabránili křížové kontaminaci reakcí PCR, včetně artefaktů primer-dimerů.9
Výtěžek specifického produktu je nízký.	Bylo provedeno příliš málo cyklů.	Zvýšit počet cyklů v krocích po 3-5 cyklech.
	Doby prodlužování jsou příliš krátké.	Zvýšit doby prodlužování v krocích po 2 minutách.
	Potřebujete kopolymer.	Přidejte dimethylsulfoxid až do konečné koncentrace 5 %.
	Možnosti primingu PCR mohou být nízké vzhledem k reakčním podmínkám nebo návrhu primerů.	Modifikujte reakční podmínky zvýšením teploty denaturace na 95 °C, prodloužením časů extenze po 2 minutách, zvýšením koncentrací MgCl2 a dNTP atd. Přepracujte primery PCR.

Odkazy

1. Barnes W. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(91):2216-2220.

2. Cheng S, ea. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(91):5695-5699.

3. Rychlik W, Rhoads RE. 1989. A computer program for choosing optimal oligonudeotides for filter hybridization, sequencing andin vitroamplification of DNA. Nucl Acids Res. 17(21):8543-8551. https://doi.org/10.1093/nar/17.21.8543

4. Lowe T, Sharefkin J, Yang SQ, Dieffenbach CW. 1990. A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain reactions. Nucl Acids Res. 18(7):1757-1761. https://doi.org/10.1093/nar/18.7.1757

5. Roux KH. 1995. Optimization and troubleshooting in PCR.. Genome Research. 4(5):S185-S194. https://doi.org/10.1101/gr.4.5.s185

6. Sambrook J, ea. 2000. Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Catalog Number M8265.

7. Rees WA, Yager TD, Korte J, Von Hippel PH. 1993. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry. 32(1):137-144. https://doi.org/10.1021/bi00052a019

8. Don R, Cox PT, Wainwright B, Baker K, Mattick JS. 1991. ?Touchdown? PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008-4008. https://doi.org/10.1093/nar/19.14.4008

9. Huang L, Jeang K. 1994. Biotechniques.(16):242-246 .

10. Kwok S, Higuchi R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature. 339(6221):237-238. https://doi.org/10.1038/339237a0