膜蛋白的溶解

這是製備膜蛋白過程中最關鍵的階段之一。在溶解階段，使用去垢劑將膜蛋白從其天然環境（脂質膜）中萃取至水環境中。

膜蛋白的疏水表面區域和脂質「尾部」埋藏在洗滌劑膠束結構的疏水內部，而蛋白質的親水部分則與水環境接觸（圖 1.1）。

在有去垢劑存在的情況下，目標蛋白可通過基本上任何現有的可溶性蛋白質純化技術進行純化。

一些膜蛋白需要與脂質雙層中的原生脂質或添加的外源脂質互動，才能保持其活性構象。在這種情況下，溶解方案必須能夠形成穩定的蛋白質-脂質-去垢劑複合物，並且不會去除與目標蛋白質相關的所需的原生脂質。苛刻的增溶和純化程序可能會導致這些必要的脂質被移除，進而導致蛋白質失活。

圖 1.1. 去垢劑溶解膜蛋白的示意圖。膜蛋白從天然脂質雙層（藍色和黃色）轉移到與去垢劑（綠色）的複合物中，某些情況下還會轉移到脂質中。圖中還顯示了脂質-清潔劑膠束、清潔劑膠束和游離清潔劑。

清潔劑和 CMC

清潔劑是具有極性（親水）頭基和非極性（疏水）尾基的兩極物質。極性部分可以是非離子、陰離子、陽離子或 zwitterionic，而清潔劑通常也會依此分類（例如，具有陰離子極性部分的清潔劑稱為陰離子清潔劑）。
表 1.3 列出了不同類別清潔劑的優缺點。

表 1.3不同等級清潔劑的優缺點

優點	非離子 (例如.g.,十二烷基麥芽糖苷）	可能產生較低的增溶產量
Ionic (anionic or cationic) (e..g.,SDS, LTAB）	通常會變性 干擾離子交換分離
齊聚物 (例如：SDS、LTAB)g.,FOS-Choline 12）	常用於膜蛋白結晶。結合了離子和非離子洗滌劑的優點	比非離子洗滌劑更具變性

在水性環境中，當清潔劑分子的濃度超過某一特定濃度時，就會結合形成內部疏水、表面親水的多分子複合物--膠束。此濃度稱為臨界膠束濃度 (CMC)。

一般而言，所有用於膜蛋白製備的緩衝液和溶液（用於溶解、純化、儲存等）的去垢劑濃度應高於 CMC。

表 1.4 中列出了推荐用于膜蛋白增溶的几种去垢剂。圖 1.4顯示了幾種不同類別的去垢劑的化學結構。

表 1.4一些建議用於溶解膜蛋白的去垢劑

清潔劑	等級1	FW	CMC2 ；(mM)
Brij™ 35	N	1200	0.07
C12E8< /a>	0.	N	539	0.11
CHAPS (3[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid)	Z	615	8
Cymal 7 (Cyclohexyl-n)-庚基-β-D-麥芽糖苷）	N	522	0.19
0./a>	N	483	1.8
地屈孕酮	N	1229	< 0.5
DDM（十二烷基麥芽糖苷）	N	511	0.17
FOS-Choline 12	Z	352	0.12
Hecameg (6-O-(N-Heptylcarbamoyl)methyl- α.-D-gluco pyranoside)	N	335	19.5
LDAO (lauryldimethylamine oxide)	Z	229	1
Nonidet P40	N	615	0.25
壬基葡糖苷	N	306	6.5
6./a>	N	292	18
吐温™ 20	N	1228	0.06
Triton X-100< /a>		0.	N	647	0.23

¹N = 非離子；Z = 齊聚物
²在 20 °C 至 25 °C 和 ~50 mM Na+

圖 1.4. 不同類別的精選清潔劑的化學結構。

去垢劑篩選

應篩選幾種不同的去垢劑和條件，以建立每種膜蛋白的最佳條件。通過檢測增溶部分中的目標膜蛋白來監控增溶產率。在下面的方案中，通過超速離心去除未溶解的物質。

也可以將未溶解的溶解物直接用於特別設計的層析柱或多孔板，以處理細胞碎片 (

)。i> expression-screening of-histidine-tagged-membrane-proteins from E. coli lysates）。

蛋白質的檢測可在 SDS-PAGE 之後使用Western blot進行。對於低表達蛋白質，可能需要先進行層析富集步驟，才能進行蛋白質檢測 (Conditioning) 。

對於高度表達的蛋白質，可透過 SDS-PAGE 搭配 Coomassie Blue 染色來估計溶出率。

除了確定溶出率和均勻性之外，通常還需要監測蛋白質活性，這是完整蛋白質結構（和功能）的最佳指標。對於某些膜蛋白，可將功能檢測應用於去垢溶解的蛋白質。在其他情況下，將膜蛋白重新插入人工脂質雙層（膜蛋白重組）是進行功能檢測的必要條件。

一般去垢劑篩選程序

緩衝液準備

PBS：10 mM 磷酸鹽，2.7 mM KCl，137 mM NaCl，pH 7.4
Tris 緩衝液：20 mM，中性 pH 表 1.5. 用於去垢劑篩選的 PBS 或 Tris 緩衝液添加劑

	除垢劑濃度 (%)	NaCl（mM）	溫度（°C）	Start condition	5	1 (always above CMC)	100	4<	2 h
變異範圍	0.4 至 2（總是高於 CMC）	4 至 37	0.

有關推薦去垢劑的清單，請參閱表 1.4

溶解

1. 從已知蛋白質濃度的膜制備開始，按表 1.5所示結合材料，使總容量達到 1 mL。
2. 在所需的溫度下輕輕攪拌孵育 45 分鐘。
3. 在 4 °C 下以 100 000 × g 離心 45 分鐘。可使用的一般檢測方法有 SDS-PAGE（進行純度和均質性檢查）、快速定性純化，然後進行凝膠過濾（）。a href="/TW/zh/technical-documents/technical-article/protein-biology/protein-purification/purity-homogeneity-check">Performing a purity and homogeneity check）和抗原性標籤規格化檢測（例如、使用標籤特異性抗體進行點印圖）。此外，還應考慮膜蛋白活性的檢測。

Performing a small-scale expression-screening of histidine-tagged membrane proteins from E. coli lysates Can adapted to a combined solubilization screening and binding screening protocol.

圖 1.5 顯示了初步溶解篩選 EM29 的結果，EM29 是來自 E. coli 的 Mr 29 000 組氨酸標記膜蛋白。在目標蛋白質的預期位置出現強烈的帶，表示高表達和/或有效的溶解。FC12、Triton X-100 和 LDAO 的帶子比其他測試的去垢劑弱。因此，這些去垢劑不太適合溶解此蛋白質。還應該說明的是，高產量或合理的產量必須與溶解後在洗滌劑溶液中保持活性和穩定性相結合，這也是下一步應考慮的篩選分析。

圖 1.5. 用 SDS-PAGE 和 Coomassie Blue 染色分析 EM29 的結合表達篩選和初步增溶篩選。測試了八種不同的洗滌劑，洗滌分兩步進行（分別為凝膠的左半部和右半部）。FC12 = FOS-Choline 12；UDM = undecyl maltoside；DDM = dodceyl maltoside；OG = octyl glucoside；TX-100 = Triton X-100；LDAO = lauryl dimethylamine oxide。數據由瑞典斯德哥爾摩 Karolinska 研究所 Said Eshaghi 博士提供。

特定的脂質可能與原生膜中的蛋白質有關聯，而這些脂質的存在對蛋白質的活性是不可或缺的。保持活性需要這些脂質在溶解和純化後仍然存在。苛刻的溶解和純化條件可能會導致這些脂質被移除，導致膜蛋白失活。

在最初的溶解測試中，DDM 通常是一種很好的去垢劑。

據報導，CHAPS和地屈寧對於溶解 Pichia pastoris的膜蛋白效果特別好。

在 大腸桿菌

中生產的GST標記膜蛋白的增溶篩選

下面描述的方法（圖1.6.）提供了一個簡單快速的方法來選擇最佳的增溶條件，以獲得最高產率的GST標記膜蛋白。此篩選程序是以 GST 對 Glutathione Sepharose 4B 媒介的適應性為基礎。用於篩選的去垢劑不得影響 GST 的結合活性。

圖 1.6. GST 標記膜蛋白的清潔劑篩選實驗。

Materials

GST Detection Module

GST SpinTrapTM 純化模組

GST MultiTrap 4B

結合緩衝液：10 mM phosphate, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 (PBS)

洗脱缓冲液：結合緩衝液補充 0.2% (w/v) 洗滌劑和 10 mM 還原型    谷胱甘肽

溶解篩選

1. 用溶菌酶處理和冷凍-解凍的方法破壞細胞，然後在 4 °C 下以 ~50,000 × g 離心 30 分鐘，分離膜（參見 "Membrane preparation from E. coli" .大腸桿菌「 在 進行細胞破壞和膜制備)。更高的離心速度和更長的離心時間（例如、
2. 將膜膠團（1:10 w/v）溶於 5% (w/v) 洗滌劑溶液中，在冰上輕微攪拌 2 小時（更多資訊請參閱 「洗滌劑篩選」）。
3. 在 4 °C、約 50 000 × g 離心 30 分鐘（或在 4 °C、18 000 × g 離心 60 分鐘）。
4. 抽取 500 µL 上清液，按照提供的說明使用 GST SpinTrap Purification Module 或 GST MultiTrap 4B 純化。使用 500 µL 洗脱缓冲液进行洗脱。使用 GST Detection Module 分析 GST 活性。
5. 使用 SDS-PAGE 進行分析（參見 進行純度和均質性檢查）。

增溶條件的優化

建立增溶的初始條件後，可以使用一種或有限數目的去垢劑進一步篩選來優化條件。需要研究的有用篩選參數有：

• 蛋白質濃度與去垢劑濃度之比。蛋白質濃度通常在 1 到 10 mg/ml 之間
• 溶解時間和混合條件（例如、輕度攪拌、端對端旋轉或劇烈攪拌）
• pH
• 離子強度

尺寸均一性可作為穩定性的指標（因此也是最佳溶解條件），因為膜蛋白在不穩定時通常會快速低聚或聚集。使用 SuperdexTM  200 5/150 GL 可以快速評估尺寸均一性（請參閱 執行純度和均一性檢查中的 「尺寸均一性表徵」）。圖 1.7 展示如何使用 SuperdexTM 200 5/150 GL（色譜柱容積 3 mL）在不同 pH 和鹽分條件下進行均一性篩檢。

圖 1.7. 篩選 pH 值和離子強度條件，以獲得去垢劑-蛋白複合物的最佳均一性和穩定性。使用 Superdex 200 5/150 GL 進行快速凝膠過濾時，在 pH 值為 5.2 的 0.1 M NaCl 溶液中進行分離時會出現對稱的峰值 (A)，顯示在此條件下蛋白質是均勻的。在較高的鹽濃度下（D），在接近空隙體積的地方出現一個小峰，顯示低聚或聚集的程度有限。在 pH 7.5 和 pH 9.5 的條件下，靠近空隙體積的地方都會出現明顯的峰值，顯示出嚴重的低聚或聚集現象。整個篩選過程只需數小時即可完成，包括色譜柱平衡時間。整個篩選過程的樣品消耗量為 6 × 10 µL。數據由瑞典斯德哥爾摩 Karolinska 研究所 Said Eshagi 博士友情提供。

也可以考慮去垢劑的混合物。

添加劑（如脂質和小的雙親物（如 1,2,3-庚三醇））或目標蛋白質的已知配體）可能對測試有用。小型兩棲物可能會透過改變洗滌劑膠束的大小來影響結晶行為。配體被認為可以降低蛋白結構的動態，從而穩定蛋白在去垢劑溶液中的結構。

純化的溶解

經過優化後，溶解方案的規模要適合需要獲得的膜蛋白量。

建議在溶解後立即進行純化，以減少由於聚集、結構損失或蛋白質分解而造成的膜蛋白活性損失。

對於特定膜蛋白溶解效果良好的去垢劑可能不太適合用於相同蛋白質的其他操作（例如：結晶）、結晶）。交換去垢劑的程序在 Conditioning.

使用有機溶劑溶解

使用有機溶劑有時可以將小而穩定的膜蛋白以其活性形式從脂質雙分子層中提取出來。例如，用氯仿：甲醇混合物從大腸桿菌中提取出110個氨基酸的膜蛋白，並在此環境下使用耐有機溶劑的色譜介質和色譜柱對提取物進行初步純化（圖1.8；13）。對於這種膜蛋白，氯仿與甲醇的比例為 1:1 時，分離效果最佳。

圖 1.8. 溶劑萃取膜蛋白的凝膠萃取分離。實線 = 過度表達 EmrE（多藥物抗性轉運蛋白）的大腸桿菌膜的有機提取物；斷線 = 「空白 」大腸桿菌膜的有機提取物。使用了兩種比例的氯仿 (C) 和甲醇 (M)。星號標示含有 EmrE 的峰值。經許可使用。版權所有 2002 Elsevier Science (USA) 出版。

圖 1.13. 利用凝膠過濾分析膜蛋白的大小均一性。使用 Superdex 200 進行凝膠過濾，分析 IMAC 純化的三種大腸桿菌膜蛋白。每種蛋白質在兩種不同去垢劑存在下分別進行 IMAC 純化。凝膠過濾分析使用與純化時相同的去垢劑。如色譜 C 中的對稱峰（不在空隙體積處）顯示蛋白沒有聚集，表明純化成功。藍線 = A280 痕跡。經授權使用。版權所有 2005 蛋白質學會。

材料

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