使用蛋白 A/G/L 琼脂糖純化抗體

本方案設計為從哺乳動物血清、腹水和細胞培養上清液中快速純化抗體的方法。需要注意的是，如果起始物是血清或腹水，最終製備物將包含內源宿主 IgG 以及特異性抗體。一般而言，內源 IgG 的存在不會干擾抗體的檢測。PURE1A Kit 用於使用蛋白 A 純化抗體。

Procedure

純化規範 (適用於 1 mL 色譜柱)

注意事項：本方案使用高摩尔度、高pH值的蛋白A上样缓冲液，以增强与蛋白A亲和力较弱的亚类（如小鼠IgG1）的结合。與蛋白 G 和 L 的結合是在中性 pH 下進行，因此使用磷酸緩衝生理鹽水作為上載緩衝液。結合的 Ig 用 pH 值為 3 的檸檬酸緩衝液單步洗脫，可去除所有與樹脂結合的亞類。蛋白 A 和蛋白 G 對來自不同物種的 IgG 的吸附能力可根據 表格 (PDF) 中的相對親和力估算。具有 1-2 pluses 的 IgG 子類會以每毫升樹脂 1-5 毫克 IgG 結合。具有 3-4 個等級的亞類會以每毫升樹脂 10-25 毫克的量結合。蛋白 L 可與所有 Ig 類別結合，對於具有 4 個等級的物種，每毫升樹脂可結合 3-10 毫克 Ig。建議使用的樹脂對於要純化的物種和 Ig 類別至少有 2 個 pluses。

試劑與設備

1. 血清、腹水或細胞培養上清液
2. 蛋白質 A 載入緩衝液：1 M 磷酸鉀，pH 9.0
3. 蛋白 G 或 L 載入緩衝液：0.01M 磷酸緩衝生理鹽水 (PBS)，pH 7.4（產品編號 P4417）
4. 洗脱緩衝液：0.1 M 檸檬酸，pH3.0
5. 1.5 M Tris 碱，用於中和洗出液
6. 3 - 5 mL 注射器（柱套），玻璃棉
7. Stopcock, Luer-Lock (Product No.S7396）
8. 環形支架，夾具
9. 試管，架
10. 分光光度計，比色皿
11. pH計
移液管、燈泡
12. 燒杯、攪拌棒和攪拌板（用於製備緩衝液）
13. 無菌過濾器（可選）
14. 疊氮化鈉（防腐劑）（產品編號：No.S2002)
    

程序

1. 準備緩衝液。緩衝液可於 4 °C 儲存 1-2 週。通過無菌過濾器過濾可延長緩衝液的壽命，但不是必需的。從注射器中取出柱塞並丟棄。將少量玻璃棉壓入注射器底部，足以形成約 1/2 - 1 cm 厚的墊子。裝上瓶塞。用 1-2 mL 上載緩衝液沖洗。
2. 倒置并旋转瓶子，将树脂悬浮在 2 mL 上样缓冲液中。避免過度振動。
3. 將漿倒入注射器。讓多餘的緩衝液流過，然後用 5 mL 上載緩衝液洗柱。不要讓樹脂完全乾透。
4. 如果可能的話，請估計要上載的血清、腹水或上清液中的 Ig 含量。如果不知道 Ig 的含量，表格（PDF）包含了不同物種的血清、小鼠腹水和細胞培養上清液中 Ig 的近似含量，可用來估計起始材料中 Ig 的含量。根據樹脂對起始材料物種的 Ig 容量（見上文註釋）和起始材料中的 Ig 含量，計算出需要載入的容量。
   
   註釋：這些是近似值，僅作為初步指南。Actual Ig concentrations in fluids and binding to the resins will vary and optimal ratios of starting material to resin must be determined experimentally.
   
   
5. Dilute serum or ascites with 3 volumes of loading buffer.
6. 將稀釋後的材料用於柱上。在試管或燒杯中收集未結合的部分，並保存以備可能的再處理。每 mL 樹脂用 5 mL 上載緩衝液洗滌未結合的蛋白質。收集相當於1/2柱容量的馏分。每 mL 樹脂使用 10 mL 洗脱緩衝液。
7. 每 mL 樹脂使用 5 mL 上載緩衝液重新校準色譜柱。檢查流出液的 pH 值，以確保柱平衡在上載緩衝液的 pH 值。(如果需要，可使用總蛋白試劑盒進行目視檢測）
8. 收集蛋白呈陽性的馏分。
9. 如果需要，可將未結合的餾分再次上柱，以回收第一次上柱時未結合的 Ig，如果上載的物質量超過柱容量，可能會出現這種情況。
10. 在 4 °C下透析到所需的緩衝液中，即PBS，pH 7。透析緩衝液的體積至少應為蛋白溶液體積的 20 倍。應至少更換 2 次透析緩衝液，每次至少 2-4 小時，以確保透析緩衝液完全平衡。
11. 如果不再進行測試，則用含 0.05 - 0.1% 疊氮化鈉的 PBS 沖洗色谱柱。
    
    注意：如果需要，可以使用梯度形成裝置（即：Protein A）從蛋白質 A 中分離小鼠和人類 IgG 異型。G6897），在 0.1 M 枸橼酸缓冲液中形成 pH 6.5 至 pH 3.0 的线性 pH 梯度。梯度總容量至少為柱容量的 10 倍。這種洗脫方法的缺點是會產生幾個峰，每個峰都必須中和並測試，而且它得到的產品比單步洗脫方法稀釋得多。