從大腸桿菌裂解物中進行組氨酸標記膜蛋白的小規模表達篩選

細胞裂解和溶解

緩衝液準備

裂解緩衝液：20 mM 磷酸鈉、100 mM NaCl、2 mM MgCl₂、20 mM咪唑、0.5 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)、5 u/mL苯並酵素、1 mg/mL溶菌酶、不含EDTA的蛋白酶抑制劑雞尾酒（濃度依製造商建議）、1-2%的精選去垢劑、pH 7.4

程序

1. 1.   在 4 °C 下以 7000-8000 × g 離心 10 分鐘或 1000-1500 × g 離心 30 分鐘，從培養物中收穫細胞。
2. 3.  每克濕細胞加入 5 至 10 mL 溶菌緩衝液，使細胞懸浮。為了防止宿主細胞蛋白與暴露的組胺結合，必須在樣品和結合緩衝液中加入低濃度的咪唑。  根據目標蛋白的敏感性，在室溫或 4 °C 下輕微攪拌靜置 2 小時。
3. 5.  必要時測量並調整 pH 值。

表達篩選程序

材料

• His MultiTrap HP 或 His MultiTrap FF
• 可處理 96 孔板的離心機

緩衝液準備

結合緩衝液：20 mM 磷酸鈉、500 mM NaCl、20 至 40 mM咪唑、0.5 mM TCEP、1 至   2% 洗滌劑，pH 7.4（最佳咪唑濃度取決於蛋白質；20 至 40 mM 適合許多蛋白質）：20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，20 到 40 mM 咪唑，0.5 mM TCEP，0.03% 十二烷基麦芽糖苷 (DDM)，1 到 2% 去污剂，pH 7.4，

洗脱缓冲液：20 mM 磷酸鈉、500 mM NaCl、500 mM咪唑、0.5 mM TCEP、0.03% DDM、1 至 2% 洗滌劑、pH 7.4

為了提高純度，在不失去結合能力的情況下，在樣品和結合緩衝液中盡可能使用高濃度的咪唑。

準備濾板

1. 從 96 孔濾板上撕下底部封條。
2. 將濾板倒置，輕輕搖動，使粘附在頂部封條上的任何培養基移出。
3. 將過濾板靠在工作台表面，剝開頂部封條。
4. 將過濾板放置在收集板上。
5. 以 200 × g 離心濾板 2 分鐘，從培養基移除乙醇儲存液。以 200 × g 離心 2 分鐘。
6. 每孔加入 500 µL 結合緩衝液以平衡培養基。200 × g 離心 2 分鐘，重複一次。
   空白試運行：樣品和緩衝液中可能使用還原劑。如果是這種情況，請用以下步驟取代步驟 7：
7. 加入 500 µL 洗脱緩衝液/孔。  以 200 × g 離心板 2 分鐘。
8. 每孔加入 500 µL 結合緩衝液 包括還原劑 以平衡培養基。以 200 × g 離心 2 分鐘，重複一次。濾板現在就可以使用還原劑了。請勿使用含有還原劑的緩衝液儲存 His MultiTrap 篩板。

離心程序

離心後，檢查所有孔是否都已排空。如果沒有，則稍微增加離心力。

離心時不要施加超過 700 × g 的力。

1. 在濾板的每個孔中加入 100 µL 的裂解液，培養 3 分鐘。
   注意： 如果蛋白產率很低，請增加孵育時間和/或輕輕攪動篩板以混和蛋白。
   注意： 如果蛋白產率很低，請增加孵育時間和/或輕輕攪動過濾板使其混合，也可以增加裂解液的量，並在每個孔中依次加入幾個等分的裂解液。
2. 以 100 × g 離心 4 分鐘或直到所有孔都空了。
3. 每孔加入 50 µL 结合缓冲液。以 200 × g 離心 2 分鐘。
4. 每孔加入 200 µL 洗滌緩衝液。200 × g 離心 2 分鐘。重複兩次。
5. 每孔加入 50 µL 洗滌緩衝液，混和 1 分鐘。
   註： 洗滌緩衝液的容量可以改變（每孔 50 至 600 µL），取決於所需的目標蛋白濃度。
6. 更換收集板，以 200 × g 離心 2 分鐘，收集洗出的蛋白。重複兩次，直到所有目標蛋白都被洗出（A₂₈₀ 應為 <0.1，表示所有蛋白都被洗出）。
   注意： 如有必要，在每次洗脱之间更换收集板，以防止目标蛋白被不必要地稀释：1% FOS-Choline™ 12、1% 十一烷基麥芽糖苷、1% 十二烷基麥芽糖苷、1% Cymal™-5、1% Cymal-6、2% 辛基葡萄糖苷、1% Triton™ X-100、1% 十二烷基二甲基氧化胺 (LDAO)。

   要優化方案，可改變樣品、結合緩衝液和洗滌緩衝液中咪唑的濃度。His MultiTrap 板常用的變化範圍是 20 到 40 mM 的咪唑。如果目標蛋白質在這些濃度下結合率太低，可嘗試 5 至 20 mM 的咪唑。一般而言，結合緩衝液和洗滌緩衝液中的咪唑濃度過低，會導致不需要的宿主蛋白吸附（因而降低純度）。咪唑濃度太高會導致目標蛋白的產率降低。

   分析

   樣品可透過 SDS-PAGE 與 Coomassie™ Blue 染色進行分析（執行純度與均勻性檢查），或透過硝酸纖維膜上的點印分析。可使用 Anti-His 抗體檢測組氨酸標記蛋白。

   細胞收割

   細胞收割的方法取決於宿主，回收膜蛋白的方案與回收細胞內水溶性蛋白的方案相同。

   大腸桿菌培養物的細胞收割

   緩衝液的準備

   PBS：10 mM 磷酸鹽，2.7 mM KCl，137 mM NaCl，pH 7.4

   離心程序

   1. 在 4 °C 下以 6000 至 9000 × g 離心 15 分鐘，收集細胞。將細胞重懸於 500 mL 冰冷 PBS 中。
   1. 於 4 °C 下以 6000-9000 × g 離心 15 分鐘。丟棄上清液。在 10 mL 冰冷 PBS 中重悬细胞颗粒，或根据需要重悬其他体积的细胞颗粒。
   2. 重悬的细胞颗粒可保存在 -80 °C 下。