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Sera-Mag™ SpeedBeads 協定

手動抗體純化程序

蛋白富集

Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles（表 1）提供了一種快速、方便的方法，可利用親和結合進行蛋白質的手動和自動磁性分離。這種微粒可用於從血清、細胞培養上清液或腹水中分離抗體，以及從細胞或組織萃取物中進行免疫沉澱和抗原的共免疫沉澱。結合的抗體或抗原可使用洗脫緩衝液從微粒中離解。

微粒可使用磁力架從溶液中人工移除，或使用自動磁性微粒處理系統自動移除。

表一Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G 磁性微粒的特性

Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles 含有重組蛋白 A/G（Mr ~50 500；SDS-PAGE 表觀分子量 Mr ~40,000 至 45,000），結合了蛋白 A 和蛋白 G 的 IgG 結合域。

蛋白 A/G包含蛋白A的四個Fc結合域和蛋白G的兩個Fc結合域，使其成為研究和純化免疫球蛋白更通用和方便的工具。

Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G 顆粒是均勻、膠體穩定、單分散、無孔的超順磁性球體，由專利的核殼法製成。

核是由苯乙烯和酸單體的自由基乳液聚合製成的羧酸鹽改性顆粒。兩層磁鐵礦 (Fe3O4) 塗佈在此核心顆粒上，因此磁性反應時間更快。表面以專利方法進行化學改性，以減少蛋白質的非特異結合。最後，蛋白質 A/G 共價結合到微粒表面。

微粒以 1% 固體 (10 mg/mL) 儲存在 0.05% 疊氮化鈉中供應，有 1 mL、5 ml 和 100 mL 三種包裝規格。

使用 Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles 前的重要資訊

  • 請勿離心、乾燥或冷凍磁性微粒。離心、乾燥或冷凍會使顆粒聚集並失去結合活性。
  • 我們建議在使用前徹底混合（渦旋、滾動或聲納）磁性蛋白 A/G顆粒。
  • 我們建議在使用前徹底混合（渦旋、滾動或聲波處理）磁性蛋白 A/G 顆粒。聲波處理是徹底、有效地重悬顆粒的首選方法。
  • 建議使用探頭式超聲波儀進行聲波處理，以重悬長期儲存和清洗步驟後的顆粒。
  • 為了減少蛋白質降解，在製備細胞裂解液時加入蛋白酶抑制劑。低pH淘洗的最佳時間為10分鐘。
  • 在下游 Western 印迹应用中使用兔抗体（一抗或二抗）时，请在室温下使用 SDS-PAGE 样品缓冲液进行洗脱。對於所有其他抗體種類，在單次使用的應用中，在 SDS-PAGE 樣品緩衝液中煮沸微粒是可以接受的。
  • Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles 可用于小规模抗体纯化和免疫沉淀，以及 Western 印迹和质谱分析。

手動抗體純化程序

所需的其他材料

  • 1.5 mL 微離心管。
  • 樣本：血清、濃縮細胞培養上清液或濃縮腹水。
  • 結合/清洗緩衝液：Tris-buffered saline (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.5) containing 0.05 % Tween®-20 detergent.
  • 洗滌緩衝液：0.1 M 甘氨酸，pH 2-3。
  • 中和緩衝液：高離子強度鹼性緩衝液，如 1 M 磷酸鹽或 1 M Tris；pH 7.5-9.
  • 磁力架（例如：MagRack 6，Cytiva、MagRack 6，Cytiva 代碼 28-9489-64）。

從血清、細胞培養上清液或腹水中純化抗體

注意：為了確保均勻性，使用前請重覆倒置、輕輕攪拌或使用旋轉平台徹底混合微粒。

  1. 將 50 μL (0.50 mg) Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles 放入 1.5 mL 微離心管中。
  2. 將試管放入磁力架，靠著試管的側邊收集微粒。
  3. 在試管中加入 1 mL 粘合/沖洗緩衝液。倒轉試管數次或輕輕攪拌 1 分鐘。
  4. 用 490 μL 綁定/沖洗緩衝液稀釋 10 μL 樣品。
    註：樣品容量可根據用戶喜好修改。
  5. 將稀釋後的樣品加入含有預洗磁性顆粒的試管中，輕輕攪拌或倒置混勻。
  6. 用磁力架收集顆粒，然後移除並棄掉上清液。
  7. 在試管中加入 500 μLof 結合/沖洗緩衝液，混勻，用磁力架收集顆粒並棄掉上清液。
  8. 在試管中加入 100 μL 洗滌緩衝液，混勻，在室溫下孵育 10 分鐘，間中攪拌。
  9. 用磁力架收集顆粒，然後移除並保存含有洗脫抗體的上清液。為了中和低 pH 值，每 100 μL 洗離液加 10 μL 的中和緩衝液。
    註： 50 μL 是建議用於抗體純化的最小顆粒量。

自動化抗體純化程序

所需其他材料

  • KingFisher™ Flex 配 96 深孔頭 (Thermo Scientific 產品編號 5400630) 或 KingFisher 96 (Thermo Scientific 產品編號 5400500)。
  • KingFisher Flex Microtiter Deepwell 96平板，V底（Thermo Scientific產品編號95040450）。
  • KingFisher Flex 96吸頭梳，用於深孔磁頭（Thermo Scientific產品編號97002534）。
  • 結合/清洗緩衝液：含 0.05% Tween®-20 洗滌劑的 Tris-buffered saline）.
  • 洗滌緩衝液：0.1 M 甘氨酸，pH 2-3。
  • 中和緩衝液：高離子強度鹼性緩衝液，如 1 M 磷酸鹽或 1 M Tris；pH 7.5-9.

儀器準備和平板設置

注意：以下方案是為 KingFisher Flex 或 KingFisher 96 儀器的一般使用而設計的。可使用儀器隨附的 Thermo Scientific BindIt™ 軟體根據客戶需求修改方案。

  1. 從 Thermo Scientific 網站下載「抗體純化」方案 (www.thermoscientific.com/kingfisher）下載到外部電腦的 BindIt 軟體中。
  2. 從外部電腦傳輸協議到 KingFisher Flex 或 KingFisher 96。有關匯入協議的詳細說明，請參閱《BindIt 軟體用戶手冊》。
  3. 根據表2設置平板。
表二使用 96 孔微孔板進行抗體測試的移液說明

注意事項

  • 如果使用的孔少於 96 個，請在每個板中填入相同的孔。例如，如果使用 A1 至 A12 孔，則在所有板中使用這些相同的孔。
  • 為確保珠粒均勻，在將珠粒加入板 1 前，請重覆倒轉、輕輕旋轉或旋轉平台，將小瓶徹底混勻。
  • 將 Tip 與深孔 96 板結合。詳細說明請參閱 KingFisher Flex 或 KingFisher 96 用戶手冊。
  • 可根據用戶喜好修改樣品容量。如果樣品容量是< 500 μL，用結合/清洗緩衝液稀釋到最終容量500 μL。

在KingFisher Flex上執行抗體純化方案

  1. 用儀器鍵盤上的箭頭選擇方案，然後按Start。詳情請參閱 KingFisher Flex 使用手冊。
  2. 推開儀器保護蓋的門蓋。
  3. 按照方案要求將板裝入 KingFisher Flex，將每塊板放置在同一方向。
  4. 處理完樣品後，按照儀器顯示器的指示移除平板。
  5. 移除每個平板後按下 Start。
  6. 移除所有平板後按下 Stop。
  7. 完成後，如果需要，為每 100 μL 洗出液加入 10 μL 中和緩衝液中和低 pH。

手動免疫沉澱 (IP) 的步驟

所需的其他材料

  • 1.5 mL 微離心管。
  • 結合緩衝液：Tris-buffered saline (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.5) containing 0.05% Tween®-20 detergent.
  • 清洗緩衝液：25 mM Tris, 0.65 M NaCl, 0.05% Tween®-20 洗滌劑, pH 7.5.
  • 低pH洗脱緩衝液：0.1 M 甘氨酸，pH 2-3。
  • 替代洗脫緩衝液：SDS-PAGE 還原樣品緩衝液。
  • 免疫共沉澱用抗原樣品。
  • 抗原樣品。
  • 細胞裂解緩衝液（用於調整 IP 反應容量）。
  • 中和緩衝液：

免疫沉淀

注意：本方案是免疫沉淀的一般指南，需要針對每種應用進行優化。

  1. 將抗原樣品與 10 μg 抗體混合。用細胞裂解緩衝液調整反應容量至 500 μL。
  2. 將25 μL (0.25 mg) Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles放入1.5 mL 微離心管中。
  3. 向微粒中加入 175 μL 洗滌緩衝液，輕輕攪拌。
  4. 將試管放入磁力架，靠著管側收集微粒。
  5. 在試管中加入 1 mL  洗滌緩衝液。倒轉試管數次或輕輕攪拌 1 分鐘。用磁力架收集微粒。
  6. 將抗原樣本/抗體混合物加入含有預洗微粒的 1.5 mL 微離心管中，在室溫下混和孵育 1 小時。
  7. 用磁力架收集顆粒，然後移除流出液並保存以備分析。
  8. 在管中加入 500 μL 洗滌緩衝液，輕輕混和 收集顆粒，然後丟棄上清液。重複此清洗兩次。
  9. 在試管中加入 500 μL 純淨水，輕輕混勻。在磁力架上收集微粒並棄掉上清液。
  10. 低pH洗脫：向試管中加入 100 μL 低 pH 洗滌緩衝液。在室溫下混和孵育 10 分鐘。磁力分離微粒並保存含有目標抗原的上清液。為中和低 pH 值，每 100 μL 洗出液加入 10 μL 中和緩衝液：管中加入 100 μL SDS-PAGE 還原樣品緩衝液，在加熱塊中以 96 °C 至 100 ºC 加熱 10 分鐘。磁力分離微粒，保存含有目標抗原的上清液。
    注意：如果您要使用兔抗體（一級或二級）進行 Western 印跡，請勿加熱樣品。在室溫下混和孵育 10 分鐘。

.自動免疫沉澱的步驟

所需的其他材料

  • 帶 96 深孔頭的 KingFisher Flex 或 KingFisher 96（Thermo Scientific 產品編號：5400630 或 5400500）。5400630 或 5400500）
  • KingFisher Flex 微量滴定深孔 96 板，V 底（Thermo Scientific 產品編號 95040450）
  • KingFisher Flex 96 深孔磁頭用吸頭梳（Thermo Scientific 產品編號 97002534）
  • 1.5 mL 微量離心管
  • 結合緩衝液：含 0.05 % Tween®-20 洗滌劑的三氫緩衝鹽水
  • 清洗緩衝液：含 0.05 % Tween®-20 洗滌劑和 0.5 M NaCl 的三氫緩衝鹽水
  • 低 pH 洗滌緩衝液：0.1 M 甘氨酸，pH 2-3
  • 替代洗脫緩衝液：SDS-PAGE 還原樣品緩衝液。
  • 抗原樣品
  • 細胞裂解緩衝液（用於製備抗原樣品）
  • 中和緩衝液：高離子強度鹼性緩衝液，如 1 M 磷酸鹽或 1 M Tris；pH 7.5-9)
  • 磁力架 

仪器准备和平板设置

注意：以下方案设计用于 KingFisher Flex 或 KingFisher 96 仪器的一般使用。使用儀器隨附的 BindIt 軟體，可以根據您的需要修改方案。

  1. 每個抗原樣品與 2-10 μg 免疫沉澱抗體混合。室溫孵育1-2小時或4ºC混勻過夜。
  2. 在外部電腦的BindIt軟體中輸入表3中的 「免疫沉澱 」方案。
  3. 從外部電腦將方案傳輸到KingFisher Flex或KingFisher 96。有關匯入方案的詳細說明，請參閱《BindIt 軟體用戶手冊》。
  4. 根據表3設置平板。
表三使用 96 孔微孔板的免疫沉淀方案的移液說明

注意事項

  • 如果使用少於 96 孔，請在每個板中填入相同的孔。例如，如果使用 A1 至 A12 孔，則在所有板中使用這些相同的孔。
  • 為確保微粒均勻，在將微粒加入板 1 前，先將小瓶重複倒置、輕輕旋轉或旋轉平台徹底混合。詳細說明請參閱 KingFisher Flex 或 KingFisher 96 使用手冊。
  • 可將顆粒洗脫至 100 μL 0.1 M glycine, pH 2-3 或 100 μL SDS-PAGE 還原樣品緩衝液中。如果在加热洗脱中使用SDS-PAGE还原样品缓冲液，请安装KingFisher Flex或96加热块（正确安装请参阅手册），在96°C至100 ºC下加热样品10分钟。
  • 如果您选择SDS-PAGE还原样品缓冲液进行洗脱，并将使用兔抗体（一抗或二抗）进行Western印迹，请不要加热样品。
  • 如果選擇低pH值的洗脫緩衝液進行洗脫，在運行完成後，每100 μL洗脫液用10 μL中和緩衝液中和pH值。
  • 為了限制蒸發，請在 「加熱動作 」副標題下選擇 「混合 」和 「慢速 」速度。

執行自動免疫沉淀協議

  1. 使用儀器鍵盤上的箭頭選擇協議，然後按Start。詳情請參閱 KingFisher Flex 用戶手冊或 Kingfisher 96 用戶手冊。
  2. 推開儀器保護蓋的門。
  3. 根據方案要求將板裝入儀器，將每塊板放置在同一方向。按Start（開始）確認每個動作。
  4. 處理完樣品後，按照儀器顯示器的指示移除平板。移除每個平板後按 Start（開始）。移除所有平板後按 Stop。

疑難排解

表 4.Sera-Mag Speedbeads Protein A/G 磁性微粒的一般故障排除提示和建議
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