核酸电泳方法 & 简介

简介
 DNA琼脂糖凝胶电泳
 RNA琼脂糖凝胶电泳
 DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳
 参考文献

简介——什么是电泳？

电泳是根据基质上的净电荷、大小和构象对核酸（DNA 和 RNA）和蛋白质等大分子进行分离纯化的方法。由于磷酸基团的存在，核酸具有整体负电荷。因此，它们向阳极移动的速度完全取决于它们的大小。蛋白质含有整体的正电荷或负电荷；这使得蛋白质分子能够向一个称为等电点的 pH 移动，在该等电点分子没有净电荷。通过对蛋白质进行变性，并给予它们均匀的电荷，就可以根据大小将它们分开。大分子在由琼脂糖或聚丙烯酰胺组成的基质或凝胶内电泳。由这些聚合物制成的凝胶含有孔隙，当施加电压时，蛋白质和核酸可以通过这些孔隙。

DNA 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海藻中提取的多糖，通常以0.5-2％的浓度用于DNA和RNA电泳。它可形成具有合适孔径的晶格，以便核酸能够移动到正极。

图 1.核酸琼脂糖凝胶电泳

实验方案：DNA 琼脂糖凝胶电泳

所需材料和试剂

电泳室，包含电源、灌胶板和点样梳
Bionic™ 缓冲液 (B6185) 或下列其中一种电泳缓冲液:

1X TAE (65497) ，包含：
     0.04 M Tris-醋酸盐 (pH 7.6)
     0.001 M EDTA

或

1X TBE (93290)，包含：
     0.13 M Tris (pH 7.6)
     45 mM硼酸
     2.5 mM EDTA
上样缓冲液 (G7654, G2526) 或在 1X TAE 或 1X TBE 中使用以下材料制备：

     50% 甘油
     0.25% 溴酚蓝 (B5525)
     0.25% 二甲苯腈蓝 FF (X4126)
BlueView™ 核酸染色剂（T9060和T8935 ）、SYBR^® Green核酸染色剂 (S9430) 或溴化乙锭：在蒸馏水中制备0.5μg/ mL。
透射仪

预制琼脂糖凝胶

Sigma-Aldrich 可提供加入溴化乙锭的8孔、20孔和24孔预制琼脂糖凝胶。如果使用预制凝胶，则继续“凝胶通电”步骤。

也可通过以下步骤自行灌制琼脂糖凝胶。

琼脂糖溶液制备

量取适量琼脂糖粉，加到烧杯或烧瓶中的 1X TAE 缓冲液中。
说明：琼脂糖量取决于所需凝胶的百分比。琼脂糖溶液的体积必须根据所用凝胶拖盘的大小来制备
在磁性加热板上加热溶解琼脂糖。也可在微波炉中加热，每分钟旋转一次，直到琼脂糖完全溶解。
当琼脂糖冷却至 50-60°C 时，向溶液中加入溴化乙锭（0.5µg/mL 最终浓度）。另一种方法是电泳后将凝胶浸入溴化乙锭溶液中。
重要提示： 溴化乙锭是一种致癌剂。处理溴化乙锭时务必佩戴手套和口罩。
琼脂糖冷却时，准备好凝胶托盘以进行灌胶，使琼脂糖溶液在凝固前不会流出。这可以通过使用托盘隔障、Flexicaster或用传统的实验室胶带密封来实现。将梳子置于凹槽中，并将托盘置于平坦的水平位置。
慢慢倒入琼脂糖溶液，使其均匀地分布在托盘上，确保没有气泡滞留在凝胶中。使凝胶在室温下固化。
取出梳子，用托盘将凝胶转移到电泳槽，加入1X电泳缓冲液，直到凝胶刚好被缓冲液覆盖。

DNA 样品制备

Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 试剂盒，用于从植物和真菌 (E5038)、哺乳动物细胞或组织 (G1N70, G1N10 和 G1N350)、以及血液 (NA2010 和 NA2020)中分离 DNA。

为保护分离的 DNA 不被降解，建议将 DNA 溶解在 TE 缓冲液中 (T9285)。

此外，DNAstable^® 试剂盒 (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用于DNA运输或确保DNA在室温下的储存和稳定。

按标准方法从细胞或组织中分离 DNA。
用溴化乙锭染色时，在琼脂糖凝胶上检出所需的最低 DNA 浓度为 2 ng。
将核酸样品与 10X 上样缓冲液混合。一般情况下，3 μL 上样缓冲液就足够了，但少于 10 μL 的样品可使用更少的量。

运行凝胶

使用移液器将样品小心地加入孔中。也可加入含有各种大小核酸片段的适当标记物(D7058, D3937, D3812)。
盖上电泳槽盖子并连接电源。样品在琼脂糖凝胶中电泳的常用电压为 90-150v。
应使用橙色 G(O3756)、溴酚蓝 (B8026) 或二甲苯靛蓝(x4126)追踪染料前沿。

凝胶染色和观察

掺入溴化乙锭的凝胶：

电泳后，将凝胶转移至紫外透射仪，并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。

未掺入溴化乙锭的凝胶：

将电泳后的凝胶转移至SYBR^® Green核酸染色剂（1:10,000 稀释，避光染色）或 0.5µg/ml 溴化乙锭染色溶液中 15-30 分钟。
如果使用 SYBR^® Green 核酸染色剂，则可在染色后立即获取凝胶图像。
如果使用溴化乙锭，将凝胶置于蒸馏水中 10-30 分钟，确保凝胶完全浸入水中。
将凝胶转移至紫外透射仪并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。

琼脂糖凝胶荧光染色

Sigma-Aldrich可提供 Nancy-520 (01494)，这是一种可用于替代溴化乙锭的荧光染色剂。它是一种更安全、更稳定、更环保的溴化乙锭替代品。Nancy-520 的激发波长为 520 nm，发射波长为 560 nm。

掺入Nancy-520 的凝胶：

灌胶时可将 Nancy-520 掺入琼脂糖中（10 μL 至 50 mL 琼脂糖）。
电泳后，获取凝胶的荧光图像。

未掺入 Nancy-520 的凝胶：

加入 10 μL Nancy-520 至 50 mL 1X TBE 缓冲液制备染色液。
电泳结束后，将凝胶浸入染色液中，并在摇床上避光保存 1小时。
用 1X TBE 缓冲液冲洗凝胶 10-30 秒。
拍摄凝胶的荧光图像。

图 2.水平电泳系统

RNA 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳可以根据RNA的大小和完整性来评估RNA的质量。然而，由于广泛的分子内碱基配对干扰了琼脂糖凝胶上基于大小的迁移，RNA形成了各种二级结构。因此，RNA 分子必须使用甲酰胺和甲醛进行变性。

实验方案：RNA 琼脂糖凝胶电泳

所需材料和试剂

确保所有使用的设备都不含RNAses，所有使用的缓冲液都采用无RNAses的水配制。

电泳室，包含电源、灌胶板和点样梳
1X MOPS-EDTA-乙酸钠 (MESA)缓冲液 (M5755):

     40 mM MOPS
     10 mM 乙酸钠
     1 mM EDTA (pH 8.3)
RNA样品缓冲液(R1386 和 R4268)

     62.5% (v/v) 去离子甲酰胺
     1.14 M 甲醛
     1.25X MESA缓冲液
     200 µg/mL溴酚蓝 (B2225)
     200 µg/ml 二甲苯腈蓝FF ( X4126 )

Sigma-Aldrich可提供含/不含溴化乙锭的RNA 样本缓冲液 (R1386)

SYBR^® Green核酸染色剂 (S9430) 或溴化乙锭：0.5μg/ mL 蒸馏水溶液
透射仪

预制琼脂糖凝胶

Sigma-Aldrich可提供 8 孔 RNA预制1.25% 琼脂糖凝胶 (P6222)。这种预制凝胶不含溴化乙锭。如果使用预制凝胶，则继续“凝胶通电”步骤。

也可通过以下步骤自行灌制琼脂糖凝胶。

琼脂糖溶液的制备

量取适量琼脂糖粉，加到烧杯或烧瓶中的 1X MESA 缓冲液中。
说明：琼脂糖量取决于所需凝胶的百分比。琼脂糖溶液的体积必须根据所用凝胶拖盘的大小来制备
在磁性加热板上加热溶解琼脂糖。也可在微波炉中加热，每分钟旋转一次，直到琼脂糖完全溶解。
当琼脂糖冷却至 50-60°C 时，向溶液中加入溴化乙锭（0.5µg/mL 最终浓度）。另一种方法是电泳后将凝胶浸入溴化乙锭溶液中。
重要提示：溴化乙锭是一种致癌剂。处理溴化乙锭时务必佩戴手套和口罩。
琼脂糖冷却时，准备好凝胶托盘以进行灌胶，使琼脂糖溶液在凝固前不会流出。这可以通过使用托盘隔障、Flexicaster或用传统的实验室胶带密封来实现。将梳子置于凹槽中，并将托盘置于平坦的水平位置。
慢慢倒入琼脂糖溶液，使其均匀地分布在托盘上，确保没有气泡滞留在凝胶中。使凝胶在室温下固化。
取出梳子，用托盘将凝胶转移到电泳槽，加入1X电泳缓冲液，直到凝胶刚好被缓冲液覆盖。

RNA 样品的制备

哺乳动物细胞或组织(RTN70, RTN10 和 RTN350)可使用TRI Reagent^® (T9424)或 GenElute™ 试剂盒从细胞或组织样品中分离 RNA
为了确定 RNA 的质量和浓度，分别在 260 nm 和 280 nm 处读取样品的吸光度。吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀为 1.8-2.1 表示 RNA的质量较好。为了通过琼脂糖电泳法进行有效检测，至少需要 5 μg 的 RNA。
将 1 体积的 RNA 样品与 2-5 体积的样品缓冲液混合。
将样品加热至 65°C 10 分钟，并立即在冰上冷却，以防止 RNA 分子复性。

运行凝胶

使用移液器将样品小心地加入孔中。如果需要，也可加入含有各种大小 RNA 片段(R7020, R7644) 的适当标记物。
盖上电泳槽盖子并连接电源。样品在琼脂糖凝胶中电泳的常用电压为 90-150v。
应使用 Pyronin Y(P9172)、溴酚蓝(B8026) 或二甲苯靛蓝(x4126) 跟踪染料前沿。

凝胶染色和观察

掺入溴化乙锭的凝胶：

电泳后，将凝胶转移至紫外透射仪，并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。

未掺入溴化乙锭的凝胶：

在无RNase的蒸馏水中轻轻洗涤凝胶 10 分钟以除去甲醛。
电泳后将凝胶转移至SYBR^® Green 核酸染色剂 (1:10,000) 或 0.5µg/ml 溴化乙锭染色溶液中 15-30 分钟。
如果使用 SYBR^® Green 核酸染色剂，则可在染色后立即获取凝胶图像。
如果使用溴化乙锭，将凝胶置于蒸馏水中 10-30 分钟，确保凝胶完全浸入水中。
将凝胶转移至紫外透射仪并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。

DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和双丙烯酰胺（N，N'-亚甲基双丙烯酰胺）反应形成高度交联的凝胶基质。丙烯酰胺凝胶可以分离长度相差仅 0.2% 的 DNA 片段。虽然蛋白质在聚丙烯酰胺上分离前必须经过SDS变性，但带负电荷的DNA分子不需要变性。与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶可以容纳更大量的样品，并提供高分辨率的 DNA 片段。

尽管DNA的预制PAGE凝胶被广泛使用，但如果PAGE是实验室的常规程序，那么成本就很高。熟练的技术人员可以以预制凝胶的仅一小部分成本轻松制备 PAGE 凝胶。内部制备的 PAGE 凝胶可提供更好的分辨率，并有助于获得一致的结果。

实验方案：DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳

所需材料和试剂

包含电源、玻璃板、垫片和点样梳的垂直电泳室

30% 聚丙烯酰胺溶液（0.45 mM 滤膜过滤，4℃ 避光保存）：

     29 g 丙烯酰胺
     1 g 双丙烯酰胺
     100 mL 双蒸水
10% 过硫酸铵溶液
TEMED
电泳缓冲液：

    1X TBE 蒸馏水溶液：
    89 mM Tris (pH 7.6)
    89 mM硼酸
     2 mM EDTA
5X 凝胶上样缓冲液：

     80% 甘油 75%
     溴酚蓝 (B5525) 0.25%
    二甲苯腈蓝 (X4126) 0.25%
     1M Tris (pH 7.4) 10 mM
     5 M NaCl 10 mM
     0.5 M EDTA 10 mM
    10% SDS 0.1%
溴化乙锭 0.5µg/ml
透射仪

重要提示：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在性质上具有神经毒性。所有步骤均应佩戴无粉手套进行。

操作流程

用去离子水和乙醇清洁凝胶浇注装置的玻璃板和垫片。
将玻璃板和垫片组装在稳定的表面上。
根据所需凝胶的百分比，使用以下体积制备凝胶溶液（制成体积为12 mL）。

* TEMED必须最后添加。

将凝胶溶液倒入组装了垫片的玻璃板中。立即插入点样梳，确保凝胶中或梳齿周围没有气泡。将凝胶在室温下放置约 30-60 分钟
聚合凝胶可用保鲜膜包裹并储存在 4°C 条件下，以备将来使用。
准备进行电泳时，将凝胶板安装在仪器上，用1X TBE缓冲液填充电泳室。建议在5v /cm下预运行约10分钟。
通过将 1 μL 样品与 5μl 5x 凝胶上样缓冲液混合来制备寡核苷酸样品。小心地将样品加入孔中，不得产生任何气泡。
大型凝胶可以约70 V电泳14-16 小时或 125-150 V电泳2-4 小时，或直到染料前沿接近凝胶底部。确保凝胶不会过热。也可让样品在冷室中进行更高电压的电泳。
用刮刀撬开玻璃板，把上面的玻璃板分开。用 0.5μG/mL 溴化乙锭溶液给凝胶染色，同时仍然将其附着在下玻璃板上 5-10 分钟。
将玻璃板上的凝胶浸泡在蒸馏水中 10-30 分钟，去除多余的染色并降低背景染色。
用保鲜膜包裹凝胶和凝胶板，倒转置于紫外透射仪上并获取凝胶图像。
样品将显示为亮带。
所需条带可用精细的手术刀切割并适当处理，以便回收 DNA。

如果在寡核苷酸中加入³⁵S或³³P核苷酸，请遵循以下步骤：

将凝胶在 10% 乙酸中浸泡 15 分钟。
将凝胶拍干，用保鲜膜包裹。
在 80°C 真空干燥器中干燥凝胶 20 分钟或更长时间。
去除保鲜膜，在暗室将凝胶暴露于 X 光胶片中。

图 3.垂直电泳系统

参考文献

Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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