Áramlási citometria hibaelhárítási útmutató: Hogyan lehet javítani az áramlási citometriás elemzést?

A flow-citometria fizikai és fluoreszcens jellemzők alapján jellemzi és/vagy rendezi a heterogén szuszpendált sejtpopulációkat. Az optimális eredmények és adatelemzés érdekében alapvető ismeretekre van szükség a fluorokrómokról és jellemzőikről, a spektrális átfedésről és a spilloverről, a kompenzációról és a szórásról, valamint az áramlási citométer azon változóiról, amelyek befolyásolhatják a mérések érzékenységét. 

A következő áramlási citometriás hibaelhárítási útmutató az áramlási citometriás kísérletek során felmerülő leggyakoribb problémák lehetséges okait és megoldásait ismerteti. Kattintson az alábbi gyakori problémákra az áramlási citometriás elemzések javítására vonatkozó, könnyen használható táblázatokba rendezett tippekért.

• Az adatfelvételi arány drámaian csökken
  
• A jel elvesztése vagy hiánya
  
• A jel elvesztése vagy hiánya
  
/a>
• magas háttér és/vagy a sejtek nem specifikus festődése
• Az eredmények napról napra való változékonysága
• Az eredmények napról napra való változékonysága
/a>
• Nagy fluoreszcens intenzitás
• Szuboptimális sejtszórási tulajdonságok
• <>a href="#antibodyworked">Az antitest más alkalmazásokban működik, de az áramlási citometriában nem

Elkötelezettek vagyunk az iránt, hogy a legjobb megoldásokat és szolgáltatásokat nyújtsuk a kutatóknak világszerte. Ez az áramlási citometriás hibaelhárítási útmutató a leggyakrabban előforduló problémákkal foglalkozik. Egyes problémák azonban az adott kísérlethez kapcsolódhatnak. Kérjük, forduljon Technikai ügyfélszolgálatunkhoz bármilyen konkrét problémával kapcsolatban, amely antitesteink áramlási citometriás alkalmazásával kapcsolatban felmerülhet. 

Az Hogyan válasszuk ki az áramlási citometriás festékeket további tippekért az áramlási citometriás kísérletek javításához.

Az akvizíciós ráta drámai mértékben csökken

Az ok	A javasolt megoldás
Elakadt folyadék útja a műszeren	A minta körülbelül 0-ra történő hígításával csökkentheti az elemzett sejtek számát.5 millió sejtet milliliterenként. A nagyobb sejtsűrűség lényegében blokkolhatja a normál áramlást, megzavarva ezzel a vizsgálatot. Elképzelhető, hogy sok használat után bármely szabványos áramlási citométer folyadékrendszere tisztításra szorul. A folyadékrendszer tisztítására a vizsgálat során vagy azt követően végezze el a szokásos tisztítási eljárásokat. Ez megakadályozza, hogy bármilyen anyag képződjön ott, ahol az egyenletes áramlás folyik.
A sejtek összecsomósodnak	A tapadó vagy ragacsos sejtek a sejtek összecsomósodását eredményezhetik. A sejtek szedése során egy agresszívebb disszociációs enzim, például tripszin használata segíthet a sejtek szuszpenzióban tartásában. Elhelyette használjon sejtszűrőt a sejtcsomók eltávolítására.

A jel elvesztése vagy hiánya 

Az ok	A javasolt megoldás
Nem elég sejt van a mintában	A vizsgálati eljárás mosási lépései során gyakori a sejtvesztés. Győződjön meg arról, hogy a sejtsűrűség az elemzés során körülbelül 0,5 millió sejt/ml szinten marad.
A célpont intracelluláris	Az intracelluláris festés biztosítása érdekében megfelelő permeabilizációs protokollt használjon. Egyes sejtfixáló szerek veszélyeztethetik bizonyos felszíni epitópok kimutatását. Ezért a legjobb, ha a festési folyamat előtt teszteljük a fixálószer hatását.
A célfehérje nem expresszálódik	A szakirodalomból ellenőrizze, hogy a vizsgált sejtekben expresszálódik-e az adott fehérje.   Győződjön meg arról, hogy a minta olyan sejteket tartalmaz, amelyek elegendő mennyiségben expresszálják a célfehérjét. Ha a célfehérjék alacsony koncentrációban vagy alacsony gyakorisággal expresszálódnak, a legjobb, ha társfestéket is tartalmaz, hogy megkülönböztesse az alacsonyan expresszált célfehérjét vagy az alacsony gyakoriságú sejtpopulációt.
A konjugációs kit nem sikerült	Kísérelje meg egy előkonjugált primer antitest használatát. Tesztelje a konjugáló készletet egy másik ellenanyaggal.
Egy többszínű kísérletben a festék fényereje és az antigén kifejeződése nem optimálisan illeszkedik egymáshoz&.nbsp;	Tekintse át a szakirodalmat, hogy ellenőrizze az antigén expressziós szintjét az adott sejttípusban. Fényes festéket használjon alacsony antigén expresszióval. Az Multicolor áramlási citometria további tippeket talál.
A sejteket esetleg stimulálni kell a célfehérje kifejeződéséhez	Egyes célpontok csak megfelelő szerrel történő stimulálás után fejeződhetnek ki. Próbáljon ki különböző stimulálószereket, koncentrációkat és/vagy a kezelés időtartamát a célfehérje expressziójának optimalizálása érdekében.
Az antigén-antitest kötődés nem lehet optimális	Ellenőrizze az antitest fajspecifikus voltát. Optimalizálja a antitest-inkubáció idő és hőmérséklet.
Az antitest lebomlott	Gondoskodjon arról, hogy az antitesteket az ajánlott hőmérsékleten tárolja. Kipróbáljon egy új adag antitestet.
A primer és a szekunder antitestek nem kompatibilisek	A jó másodlagos antitest használata jelentősen javíthatja az eredményeket, és kiküszöbölheti vagy csökkentheti a hamis pozitív vagy negatív festést. Az elsődleges ellenanyag osztályának és/vagy alosztályának megfelelő másodlagos ellenanyagot használjon. Az elsődleges ellenanyagot tenyésztett faj ellen tenyésztett másodlagos ellenanyagot használjon. Lásd Hogyan válasszunk másodlagos ellenanyagot további tippekért.
Túl sok elhalt sejt van a mintában	Az antitestek hajlamosak megtapadni az elhalt sejteken, ami hamis pozitív eredményt eredményezhet. A sejtek egészségének értékeléséhez a legjobb, ha életképességi festéket használunk. Kipróbáljunk egy friss sejtkészítményt.
Nem elég antitest	A jel hiánya azt jelezheti, hogy a festési eljárás során többlet antitestet kell használni. Egyes sejttípusok esetében további antitest-titrálásokra lehet szükség az ideális festési koncentráció eléréséhez.

Magas háttér és/vagy a sejtek nem specifikus festése

Az ok	A javasolt megoldás
Túl sok antitest	A nem specifikus festés és a háttér azt jelezheti, hogy kevesebb antitestet kell használni a festési eljárás során. Egyes sejttípusok esetében további antitest-titrálásokra lehet szükség az ideális festési koncentráció eléréséhez.
Keresztreaktivitás a másodlagos antitest(ek) és egy elsődleges antitest között a kísérletben	Válasszon olyan másodlagos antitestet, amely specifikusan kötődik az elsődleges antitesthez. Előre konjugált primer ellenanyagot használjon.
Nem specifikus sejteket célzottan		Az megfelelő izotípus-kontrollt, és vonja le az Fc-kötődést jelző jelet. Ha szükséges, mellékeljen egy másodlagos antitest-konjugátum kontrollt. Válasszon olyan másodlagos antitestet, amely nem mutat keresztreaktivitást. A sejteket festés előtt előinkubálja megfelelő Fc-blokkolókkal, hogy csökkentse a sejtek nem specifikus kötődését. A sejtek festésekor 1-5% BSA-t adjon a PBS-hez, hogy csökkentse a sejtek nem specifikus kötődését.
Túl sok másodlagos ellenanyag	Ha másodlagos ellenanyagot használ, próbálja tovább csökkenteni a másodlagos ellenanyag mennyiségét.

Az eredmények napról napra való változékonysága

Az ok	A javasolt megoldás
Változások a sejtek életképességében	Kísérleti sejtkultúrák ellenőrzése annak biztosítása érdekében, hogy a sejtek életképessége és az elemzett sejtek száma konzisztens legyen.
Készülékkalibrációs változások	Minőségi ellenőrzést végez a műszeren (Pl, kalibrálás) naponta vagy a használat előtt.
Egyszerre különböző ellenanyagtételeket használtak	Kísérletenként egy-egy ellenanyagtételt használjon. Előre konjugált primer ellenanyagot használjon.

Magas fluoreszkáló intenzitás

Az ok	A javasolt megoldás
magas antitestkoncentráció	csökkentse az egyes mintákhoz hozzáadott antitest mennyiségét.
Többlet a csapdába esett antitestből		Megfelelő mosást végezzen, és a mosópufferbe tegyen mosószert, például Tween® 20 vagy Triton® X-100 reagenseket.
Túl sok másodlagos ellenanyag	Ha másodlagos ellenanyagot használ, próbálja tovább csökkenteni a másodlagos ellenanyag mennyiségét. Próbálkozzon előkonjugált primer ellenanyaggal. Használjon a gyártó által hitelesített reagenseket a másodlagos antitestek erősítő hatásának korlátozására.

Szuboptimális sejtszórás tulajdonságai

Az ok	A javasolt megoldás
Hibás műszerbeállítás	Győződjön meg arról, hogy a megfelelő műszerbeállítások vannak betöltve.
Gyengén fixált vagy permeabilizált sejtek	Kövesse a standard rögzítési és permeabilizálási protokollt. Kerülje el a sejtek hipotóniás oldatba vagy metanolba történő gyors merítéssel történő károsítását.

Az antitest más alkalmazásokban működött, de az áramlási citometriában nem

Az ok	A javasolt megoldás
Az ellenanyag nem volt alkalmas és nem ajánlott áramlási citometriához	Áramlási citometriás alkalmazásokhoz tesztelt és ajánlott ellenanyagot használjon. Lépjen kapcsolatba a műszaki ügyfélszolgálattal a webes itt, vagy hívja őket itt.