Apoptózis vizsgálatok
Cellalapú próbák az apoptózis kimutatására
Az apoptózis vagy programozott sejthalál egy olyan növekedéskorlátozó szabályozási mechanizmus, amellyel a sejtek a sejten kívüli jelekre válaszul, helyrehozhatatlan sejt- vagy DNS-károsodás miatt képesek saját halálukat kiváltani. A daganatos sejtek apoptózist elkerülni képes képessége a legtöbb ráktípus egyik jellemzője. Az apoptózis fontos szerepet játszik a fejlődési mechanizmusokban is, például a fejlődő agyban a neuronális sejtvonalak túlburjánzásának megakadályozásában és a végtagok fejlődésében az interdigitális távolság szabályozásában. Autophagy és az apoptózis összefügg, és a kettő között kiterjedt keresztbeszélgetés zajlik. Tápanyaghiány esetén például az autofágia túlélést elősegítő mechanizmusként működik. A túlzott autofágia azonban sejthalálhoz vezethet, amely folyamat morfológiailag különbözik az apoptózistól. Az apoptózis egy többlépcsős folyamat, amely korai, középső és késői sejteseményeket foglal magában, és amely különböző sejtes vizsgálatokkal kimutatható, beleértve az alábbiakban ismertetett Annexin V, kaszpáz és TUNEL kimutatási módszereket.
Az apoptózis stádiumai
A korai stádium eseményei: A foszfatidil-szerin áthelyeződése a plazmamembrán külső levelére (1), a mitokondriális membránpotenciál elvesztése (2), citokróm C & ATP felszabadulása (3) és a kaszpáz-8 és 9 aktiválódása (4).
középső stádiumú események: A kaszpáz-3, 6 és 7 aktiválása (5), a poli-ADP-Ribóz-polimeráz (PARP) hasadása (6), a sejt zsugorodása (7) és a nukleázok aktiválása (8).
késői stádiumú események: DNS-fragmentáció (9), magösszeomlás (10), apoptotikus testek képződése (11) és makrofágok általi fagocitózis (12).
Felső stádiumú apoptózis
Annexin V vizsgálatok: A foszfatidil-szerin normális esetben az életképes sejtek belső membránlevelében korlátozódik. A foszfatidil-szerin transzlokációja a nyílt membránfelszínre az apoptózis korai eseménye, ahol jelként szolgál a fagocita sejtek támadásához. Az annexinek szerkezetileg rokon fehérjék családja, amelyek specifikusan képesek kötődni a sejtmembránokhoz. Az Annexin V nagyon nagy affinitással rendelkezik a negatív töltésű foszfatidil-szerint tartalmazó membránokhoz, és a korai apoptózis eseményeinek markereként használható.
1. ábra.Az apoptózis induktorok különböző koncentrációival kezelt és Annexin Red Kit (FCCH100108) segítségével festett Jurkat sejteket ábrázoló pontdiagramok. A Jurkat sejteket kezeletlenül (A ábra), vagy 0,1 uM (B ábra), illetve 3 uM Staurosporinnal (C ábra) kezelték, majd a FlowCelllect Annexin Red Kit segítségével festették.
Mitokondriális detektálás: A mitokondriumok fontos sejtorganellumok, amelyek fenntartják a sejtek energiaegyensúlyát, kulcsfontosságú szabályozókat tartalmaznak a sejthalál folyamataiban, mint például az apoptózis, és jelentős szerepet játszanak a sejtek oxidatív stresszének kialakulásában. A mitokondriális membránpotenciál összeomlása feltehetően egybeesik a külső mitokondriális membrán permeabilizációjával, valamint a citokróm C és más pro-apoptotikus fehérjék citoszolba történő felszabadulásával, ami aztán elindítja az apoptotikus kaszkád downstream eseményeit.
Apoptózis középső stádiuma
Kaszpáz detektáló tesztek: Az apoptotikus folyamat központi eleme a kaszpázoknak nevezett proteolitikus enzimek kaszkádja. A kaszpázok egy sor olyan reakcióban vesznek részt, amelyek pro-apoptotikus jelzésekre válaszul indulnak be, és a fehérje szubsztrátok hasítását eredményezik, ami a sejt szétesését okozza. A kaszpáz enzimek specifikusan felismernek egy 4 vagy 5 aminosavból álló szekvenciát a célszubsztráton, amely szükségszerűen tartalmaz egy aszparaginsav-maradékot. Ez a maradék a célpontja a hasításnak, amely az aszparaginsav-maradék karbonilvégén történik.
Az immunsejtek apoptózisának élő sejtképalkotása a CellASIC® ONIX2 mikrofluidikai rendszerrel
2. ábra. A mitokondriális membránpotenciál, a kaszpáz-aktivitás és az apoptózis élő sejtes kimutatása MCF-7 emlőráksejtekben.Kezeletlen MCF-7 sejtek (86012803) (A) vagy egy éjszakán át staurosporinnal (S5921) kezelt sejtek apoptózis kiváltására (B), majd BioTracker™ 405 kék mitokondrium festékkel (SCT135), BioTracker NucView® 530 vörös kaszpáz-3 festékkel (SCT105) és CF®488A Annexin V-vel 30 percig 37°C-on, sejttenyésztő közegben, mosás nélkül. Az egészséges sejtek mitokondriális festődést mutatnak (cián), az apoptotikus sejtek elvesztik a kék festődést (cián), és a sejtmagok fokozott festődését (piros), valamint a sejtmembránok CF®488A Annexin V festődését (zöld).
Apoptózis késői szakasza
TUNEL-mérések: Az apoptózisban bekövetkező DNS-fragmentáció általában a sejtmorfológia strukturális változásaival jár együtt, és a késői stádiumú apoptózis egyik jellemzője. Az apoptózisban bekövetkező DNS-fragmentáció a TUNEL-teszttel vizsgálható. A in situ TUNEL-teszttel kimutatott DNS-szálszakadások festése és az ezt követő fénymikroszkópos vizualizáció biológiailag jelentős adatokat szolgáltat a DNS-károsodásról és a késői stádiumú apoptózisról.
3. ábra.Az ApopTag™ apoptózis-készletcsalád a DNS-fragmentációt TUNEL-teszttel vizsgálja. A DNS-szálszakadások kimutatása a szabad 3'-OH végződések enzimatikus jelölésével történik, módosított nukleotidokkal. Ezek a DNS-fragmentáció során keletkező új DNS-végződések jellemzően a morfológiailag azonosítható sejtmagokban és apoptotikus testekben lokalizálódnak.
4. ábra.A) Apoptotikus sejtek kimutatása emberi nyirokcsomóban ApopTag® peroxidázzal (S7200). A szövetet 10% semleges pufferelt formalinban fixáltuk és paraffinba ágyaztuk. B) Apoptotikus sejtek kimutatása ApopTag® Fluorescein Direct kit (S7160) segítségével egér embrió elülső végtagbimbójában, amelyet 10% semleges pufferelt formalinban fixáltak és paraffinba ágyaztak. C) Apoptotikus sejtek kimutatása ApopTag® Red (S7165) készlettel 10% semleges pufferelt formalinban rögzített és paraffinba ágyazott emberi nyirokcsomószövetben.
H2A.X Assays: Kétszálú DNS-törések (DSB) keletkeznek, amelyek gyorsan a H2A hisztonváltozat foszforilációját eredményezik.X. Mivel a H2A.X foszforilációja Ser139-nél jól korrelál minden egyes DSB-vel, a foszfo-H2A.X érzékeny marker, amelyet a DNS-károsodás és a késői stádiumú apoptózis vizsgálatára használnak.
Következtetés
A programozott sejthalált (apoptózist) több jelátviteli és effektor útvonal irányítja, amelyek a mitokondriális depolarizációhoz, a kaszpázzal kapcsolatos apoptotikus enzimkaszkádokhoz, a DNS-fragmentációhoz és végül a sejtek vérzéséhez és pusztulásához kapcsolódnak. Ezeknek és más kapcsolatoknak az integritása genetikailag veszélyeztetett lehet számos betegségben, például a rákban, ami az apoptózis kimutatását és mérését rendkívül hasznossá teszi számos kutatási vizsgálatban. Jól publikált apoptózis-méréseink, beleértve a TUNEL-mérések ApopTag® családját és az In Situ Caspase detektáló vizsgálatok CaspaTag™ családját, lehetővé teszik a sejthalál mechanizmusainak reprodukálható megismerését.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?