Trypsin inhibitorok

• Tripszin-inhibitor termékek
• Sejtkultúra alkalmazás
• Trypszin inhibitor vizsgálati eljárás

A természetes tripszin inhibitorok, más néven szerin proteáz inhibitorok (szerpinek) a proteáz inhibitorok legnagyobb és legváltozatosabb családja.¹ A szerpinek a szerinproteázok gátlásával szabályozzák a fehérjék aktiválódását és katabolizmusát in vivo.²

A tripszin inhibitoroknak négy természetes forrása van: szarvasmarha hasnyálmirigy, ovomucoid, szójabab és lima bab. Mindegyik inhibitor kompetitív szubsztrátanalógként viselkedik, és a szerinproteázzal kötődve inaktív komplexet képez, ezáltal inaktívvá teszi a proteázt.³

Ez a folyamat lehetővé teszi, hogy a szerpin (tripszin inhibitor) leállítsa a szerinproteáz proteolitikus aktivitását, amikor annak funkciójára már nincs szükség.

A tripszin inhibitorok forrástól függően egyedi folyamatokat biztosítanak. Például a hüvelyesek (szójabab és limabab) magvaiban lévő inhibitorok a bélközépi proteázok megzavarásával táplálkozásgátlóként hatnak a rovarok számára. Ezt a természetes funkciót a rovaroknak ellenálló transzgenikus növények kifejlesztése során bővítik. A szója inhibitorairól azt is megállapították, hogy patkányoknál hozzájárulnak a hasnyálmirigy hipertrófiájához, ami szintén táplálkozást gátló hatású. A Bowman-Birk szójainhibitort rákmegelőző szerként vizsgálják.⁴ 

Termékek

Termékek

1. ábra. T0256 - Szarvasmarha hasnyálmirigyből származó tripszin inhibitor

Szinonimája: BPTI (bázikus hasnyálmirigy-tripszin inhibitor)
M.W.: ~6,5 kDa (egyláncú 58 aminosavból álló peptid)
pI: ~10,5
Specifikus aktivitás: Egy mg tripszin inhibitor több mint 1,5 mg tripszint gátol, ~10,000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással
Új-Zélandról származó hasnyálmirigyből származik
Oldhatóság: 1 mg tripszin inhibitor több mint 1,5 mg tripszint gátol: A termék vízben oldódik (2 mg/ml)

ABPTI egy 58 aminosavból álló, egyetlen polipeptidlánc 3 diszulfidkötéssel.⁵

ABPTI gátolja mind a szarvasmarha-, mind a humán tripszint, a kimotripszint, a kallikreint és a plazmint. A BPTI nem gátolja a sertés elasztázt.⁶

 

2. ábra. T9253 - Trypsin inhibitor csirke tojásfehérjéből (II-O típus)

Szinonim: M.W.: ~28 kDa
pI: 4.1⁷
Specifikus aktivitás: Ovomucoid
M.W.: ~28 kDa
pI: 4.1⁷
Specifikus aktivitás: Egy mg gátolja 0,8-1,2 mg tripszin működését ~10 000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással. Gátolhatja ≤ 0,3 mg kimotripszint, kb. 40 BTEE egység per mg fehérje aktivitással.
Oldhatóság: A termék 0,67 M foszfát pufferben, pH 7,6-ban oldódik (2 mg/ml).

A csirke ovomucoid egy fő glikoprotein, amely gátolja a szarvasmarha tripszint. 186 aminosavból áll, amelyek három tandemdoménben helyezkednek el.⁸ Mindegyik domén három diszulfidkötést, két tirozinmaradékot és egy aktív centrumot tartalmaz.⁹ Az ovomucoidot a tripszin egyfejű inhibitoraként írják le, ami azt jelenti, hogy minden egyes ovomucoid molekula 1:1 arányban kötődik a tripszinhez.⁷

A termék tartalmaz némi ovoinhibitort. Az ovoinhibitor egy másik proteáz inhibitor a csirke tojásfehérjéből. Az ovoinhibitor legalább öt kötőhellyel rendelkezik, és felelős a szarvasmarha tripszin, a szarvasmarha kimotripszin és a sertés elasztáz gátlásáért.¹⁰ A tripszin és a kimotripszin egyenként 2 kötőhelyet foglal magában, míg az utolsó hely az elasztázt köti.¹¹ Az ovomucoid és az ovoinhibitor a két legnagyobb mennyiségben előforduló proteáz inhibitor a csirke tojásfehérjében, a fehérje 11 és 1,5%-át teszik ki.¹²

T2011 - Trypszin inhibitor csirke tojásfehérjéből

III-O típus (ovoinhibitortól mentes)
Szinonima: Ovomucoid
M.W.: ~27 kDa
Spécifikus aktivitás: Egy milligramm termék 1,0-2,0 mg tripszint gátol ~10.000 BAEE egység/mg fehérje aktivitással
Oldhatóság: 1,0-2,0 mg tripszint gátol: Ez a termék 0,67 M foszfát pufferben, pH 7,6-ban oldódik (2 mg/ml)

A termék ugyanazokkal a tulajdonságokkal rendelkezik, mint a fent leírt termék T9253, de az ovoinhibitor eltávolítása érdekében ammónium-szulfát vágással és szűréssel tovább tisztított. Az ovoinhibitor hiánya még tisztább ovomucoidot eredményez, amely továbbra is 1:1 komplexben gátolja a tripszint.

T4385 - Trypszin inhibitor pulykatojásfehérjéből

Típus II-T
Szinonim: Pulyka Ovomucoid
M.W.: ~20 kDa
Specifikus aktivitás: Egy mg gátolja 0,9-1,3 mg tripszint ~10.000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással vagy 0,4-1,0 mg α-kimotripszint ~40 BTEE egység per mg fehérje aktivitással
Oldhatóság: A termék 0,67 M foszfát pufferben, pH 7,6-ban oldódik (1 mg/ml)

A pulykatojásfehérjéből származó tripszin inhibitor két független kötőhelyet tartalmaz, az egyiket a szarvasmarha tripszinhez, a másikat az α-limotripszinhez. Alacsony ph-nál (2,0) egy harmadik domén (OMTKYT3) alakul ki és gátolja a legtöbb szerin proteázt, amelyek a semleges komplexhelyet részesítik előnyben.¹³

Kunitz és Bowman-Birk (BBI) szójabab-proteáz-inhibitorok

Ez a két fehérje a szójababban a legnagyobb mennyiségben előforduló proteáz-inhibitor. A 8 kDa molekulatömegű BBI mind a tripszin, mind a kimotripszin erős inhibitora, és mindegyikhez független kötőhelyeket tartalmaz. A 20,1 kDa molekulatömegű Kunitz-inhibitor egy kötőhelyet tartalmaz, amely erősen gátolja a tripszint, míg a kimotripszinhez gyengén kötődik.

3. ábra. Tripsin inhibitor Glycine max-ból (szójabab): Kunitz-inhibitor

Szinonimák: M.W.: 20,1 kDa
pI: 4,5²⁵
Extinkciós együttható: Kunitz Trypsin Inhibitor, Tia1, STI és SBTI
M.W: E1% = 9,94
(280 nm, pH 7,6 puffer)

A szója tripszin inhibitorát először Kunitz izolálta.¹⁴ A szójában számos más rokon inhibitor is megtalálható.¹⁵ A szójababból származó tripszin-inhibitor egy monomer fehérje, amely 181 aminosavmaradékot tartalmaz egyetlen polipeptidláncban, amely két diszulfidhíddal keresztben kapcsolódik.^16-18

A szója tripszin inhibitor gátolja a tripszint, és kisebb mértékben a kimotripszint¹⁹ és a plazmint.²⁰ A szója tripszin inhibitor a tripszinhez hasonló mechanizmus révén más proteázokat is gátol. Az SBTI gátló hatást fejt ki a plazma kallikrein és a Xa alvadási faktorral szemben. A szójabab tripszin inhibitor azonban nem gátolja a metalloproteázokat, a szöveti kallikreint, a savas proteázokat vagy a tio proteázokat.

A szójabab tripszin inhibitor 1:1 sztöchiometrikus komplexet képez a proteáz aktív helyével. E komplex kialakulásakor a tripszin az inhibitor egyetlen arginin-izoleucin kötését hasíthatja.^21,22 A gátlás reverzibilis és pH-függő. E komplex disszociációja az inhibitor módosított vagy natív formáját eredményezheti.²³ A tripszin kötődéséhez az optimális pH 8.0, az asszociációs állandó pH 8,0-nál nagyobb, mint 10⁹, pH 3,6-4,4-nél pedig 0,15-2,6 x 10⁴ 0,15-2,6 x 10⁴ asszociációs állandóval rendelkezik.²⁴

T9003 - Trypszin inhibitor a szójababbólGlycine max (szójabab)Glycine max  (szójabab)
Típus I-S
Ez a termék kromatográfiailag DEAE szefarózon tisztított és 10% nátrium-foszfát puffer sókat tartalmaz, pH 7.6.
Specifikus aktivitás: Egy mg 1,0-3,0 mg tripszint gátol ~10.000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással.
Egy timotripszin egység 1,0 µmol BTEE-t hidrolizál percenként pH 7,8-on, 25 °C-on.
Oldhatóság: A tripszin inhibitor 10 mg/ml koncentrációban oldódik vízben és foszfátpufferekben. Kiegyensúlyozott sóoldatokban (1 mg/ml) és szérummentes közegben is oldódik. A 10 mg/ml-nél nagyobb koncentrációjú oldatok zavarosak lehetnek és sárgától a borostyánszínűig terjedő színűek.
Tárolás/tarthatóság: Ez a termék -20 °C-on fagyasztott aliquotokban aktív marad, de a fagyasztást-felolvasztást kerülni kell. Ez a fehérje rövid, 80 °C-ra történő melegítéssel reverzibilisen denaturálódik, 90 °C-ra történő melegítéssel pedig irreverzibilisen denaturálódik.¹⁵

T6522 - Trypsin inhibitor a Glycine max (szójabab)
Típus I-S
Sejtkultúrában tesztelt
Ez a termék kromatográfiailag DEAE szefarózon tisztított és 10% nátrium-foszfát puffersót tartalmaz, pH 7.6.
Specifikus aktivitás: Egy mg 1-3 mg tripszint gátol, ~10,000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással
Oldhatóság: A tripszin inhibitor 10 mg/ml koncentrációban vízben és foszfátpufferekben oldódik. Kiegyensúlyozott sóoldatokban (1 mg/ml) és szérummentes közegben is oldódik. A 10 mg/ml-nél nagyobb koncentrációjú oldatok zavarosak lehetnek és sárga vagy borostyánsárga színűek.
Tárolás/tarthatóság: Ez a termék -20 °C-on fagyasztott aliquotokban aktív marad, de a fagyasztást-felolvasztást kerülni kell. Ez a fehérje rövid, 80 °C-ra történő melegítéssel reverzibilisen denaturálódik, 90 °C-ra történő melegítéssel pedig irreverzibilisen denaturálódik.¹⁵

T6414 - Trypszin inhibitor from Glycine max (szójabab)
A termék steril szűrt, sejttenyésztett 1x oldat (0.1%-os tripszin inhibitor oldat Dulbecco's PBS-ben), amely alkalmas sejtkultúrás alkalmazásokban való felhasználásra. Endotélsejtek passzázsára optimalizálták.
Tárolás/tartósság: Ez a termék fagyasztott aliquotokban -20 °C-on is aktív marad, de a fagyasztást-felengedést kerülni kell. Ez a fehérje rövid, 80 °C-ra történő melegítéssel reverzibilisen denaturálódik, 90 °C-ra történő melegítéssel pedig irreverzibilisen denaturálódik.¹⁵

T9008 - Trypsin inhibitor from Glycine max (szójabab) 1%-os oldat vízben
Szervezetek sejtkultúrás alkalmazásaihoz
A T9003-ból készült, steril szűréssel és feldolgozással puffer nélküli, kényelmes oldatot kapunk.
Tárolás/tartósság:
Tárolás/tartósság: Ez a termék 2-8 °C-on tárolható. Ez az oldat fagyasztott aliquotként is tárolható -20 °C-on, de a fagyasztási-olvasztási ciklusokat kerülni kell. Ez a fehérje rövid, 80 °C-ra történő melegítéssel reverzibilisen denaturálódik, 90 °C-ra történő melegítéssel pedig irreverzibilisen denaturálódik.¹⁵

T9128 - Trypszin inhibitor a Glycine max (szójabab) 
 
Típus II-S
Ammónium-szulfát frakcionálással és egy sor tisztítási lépéssel együtt állították elő, hogy 90% fehérjét és 10% nátrium-foszfát puffersót tartalmazó terméket kapjanak, pH 7.6.
Specifikus aktivitás: Egy mg legalább 1,0 mg tripszint gátol, ~10 000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással.
Oldhatóság: Ez a termék vízben oldódik (1 mg/ml). Nagyobb koncentrációjú (10 mg/ml-nél nagyobb) oldatok homályosak lehetnek és sárga vagy borostyánsárga színűek.
Tárolás/tarthatóság: Ez a termék fagyasztott aliquotokban -20 °C-on is aktív marad, de a fagyasztást-felolvasztást kerülni kell. Ez a fehérje rövid, 80 °C-ra történő melegítéssel reverzibilisen denaturálódik, 90 °C-ra történő melegítéssel pedig irreverzibilisen denaturálódik.¹⁵

T2327 - Trypszin inhibitor a Glycine Max ból.(szójabab)
≥98% Kunitz típusú inhibitor
Tovább tisztítva kromatográfiásan a T9128 -ból, hogy tiszta Kunitz típusú tripszin inhibitort kapjunk.
Ez a termék 10% nátrium-foszfát puffersót tartalmaz, pH 7,6.
Specifikus aktivitás: Egy mg gátolja ≥ 1,6 mg tripszint, ~10 000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással.
Oldhatóság: A tripszin inhibitor vízben és foszfátpufferekben 10 mg/ml-nél nagyobb koncentrációban oldódik, zavaros lehet és sárga vagy borostyánsárga színű.
Tárolás/tarthatóság: A termék fagyasztott aliquotokban -20 °C-on is aktív marad, de a fagyasztást-felolvasztást kerülni kell. Ez a fehérje rövid, 80 °C-ra történő melegítéssel reverzibilisen denaturálódik, 90 °C-ra történő melegítéssel pedig irreverzibilisen denaturálódik.¹⁵

<<Tripszin-chymotripszin inhibitor a Glycine max (szójababból): Bowman-Birk inhibitor

4. ábra. T9777 - Trypszin-chymotripszin inhibitor Glycine max-ból (szójabab)

Szinonimája: Bowman-Birk inhibitor (BBI)
CAS-szám: 37330-34-0
Egységmeghatározás: Egy tripszin egység 0,001 ΔA₂₅₃ -t produkál percenként BAEE-vel mint szubsztráttal, pH 7,6-on, 25 °C-on; reakciótérfogat 3,2 ml, 1 cm-es fényút.
M.W.: 8 kDa²⁹

A szójababból származó Bowman-Birk-inhibitor (BBI) egy monomer fehérje, amely 71 aminosavat tartalmaz egyetlen polipeptidláncban, amelyet hét diszulfidhíd köt össze.²⁶ Ez az inhibitor két független gátló kötőhelyet tartalmaz, az egyik a tripszinhez, a másik a kimotripszinhez.²⁷ A BBI mindkét proteázhoz 1:1 komplexet alkotva kötődik. Mivel a gátlás nem kompetitív, a BBI mindkét enzimmel képes terner komplexet képezni.²⁸

A termék kromatográfiailag DEAE szefarózon tisztított, és 20% nátrium-foszfát puffer sókat tartalmaz, pH 7,6.
Specifikus aktivitás: Egy mg fehérje ≥0,5 mg tripszint gátol, ~10 000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással.
Egy mg fehérje ≥1,0 mg kimotripszint gátol, ~40 BTEE egység per mg fehérje aktivitással.
Oldhatóság: A tripszin-limotripszin inhibitor vízben vagy 0,67 M nátrium-foszfátban, pH 7,6-ban (1 mg/ml) oldódik.

Tripszin inhibitor a Phaseolus limensis (lima bab) terméséből:

Szinonimák: lima babból származó tripszin inhibitor és LBTI
M.W.: 9 kDa
pI: 4,5²⁵
Extinkciós koefficiens: (280 nm, pH 7,6 puffer)

A limai babból származó tripszin inhibitor egy 83 aminosavból álló monomer, amely képes koncentrációfüggő dimerizációra. Az önasszociáció mértéke a variáns típusától és a pH-tól függ.³⁰

Az Phaseolus limensis -ből származó trripszin-inhibitornak négy-hat variánsa van, amelyek gátló aktivitása a tripszinnel szemben lényegében azonos; míg a kimotripszin gátlása tekintetében némi különbség van. A variánsok aminosav-szekvenciái hasonlóak, mindegyik 7 diszulfidkötést tartalmaz.³¹

A triptin-inhibitor 1:1 sztöchiometrikus komplexet képez a proteáz aktív centrumával. Az inhibitor komplexe akár a tripszinnel, akár a kimotripszinnel nem fejt ki további gátló hatást több azonos enzimmel szemben, de a másik enzimmel szemben teljes aktivitást mutat (1:1:1:1 komplexet képez).^30,32 Ez azt jelenti, hogy a tripszin számára egy kötőhely, a kimotripszin számára pedig egy másik. A tripszin egy Lys-Ser-helyhez, míg a kimotripszin egy Leu-Ser-helyhez kötődik.³¹ A gátlás reverzibilis és pH-függő. A komplex disszociációja az inhibitor módosított vagy natív formáját eredményezheti.²³ A tripszin kötődéséhez az optimális pH 8.0, az asszociációs állandó nagyobb, mint 10⁹ pH 8,0-nál, és 0,15-2,6 x 10⁴ közötti asszociációs állandó pH 3,6-4,4-nél.²⁴

T9378 tripszin inhibitor a Phaseolus limensisből. (limabab)
A termék liofilizált por, amely 10% nátrium-foszfát puffersót tartalmaz, pH 7.6.
Specifikus aktivitás: Egy mg legalább 0,8 mg tripszint gátol, ~10.000 BAEE egység per mg fehérje aktivitással.
Oldhatóság: A tripszin inhibitor vízben és foszfátpufferekben 1 mg/ml koncentrációban oldódik. Kiegyensúlyozott sóoldatokban és szérummentes közegben is oldódik. A 10 mg/ml-nél nagyobb koncentrációjú oldatok zavarosak lehetnek és sárga vagy borostyánsárga színűek.

Cellakultúrás alkalmazás

A triptin-inhibitorokat sejtkultúrás alkalmazásokban használják a sejtdiszszociáció során a triptinaktivitás további gátlására a sejtkárosodás/halál megelőzése érdekében.

Eljárás:
A sejtek tripszinálása után reszuszpendálja a sejteket 1 mL tripszin inhibitor oldatban (1 mg/ml kiegyensúlyozott sóoldat vagy szérummentes közeg használatával) minden egyes mL tripszin oldatban, amelyet a disszociációhoz használ. Centrifugáljuk a sejtszuszpenziót 1000 rpm-en 5 percig. Egy sejtpelletnek kell kialakulnia. Távolítsunk el annyi tripszin-inhibitort, amennyit csak lehet, és szuszpendáljuk újra a pelletet szérummentes tápfolyadékban. A sejteket a kívánt módon tenyészteni kell.

A tripszin-inhibitor aktivitás vizsgálati módszere

A legtöbb tripszin-inhibitor készítmény aktivitását folyamatos sebességű spektrofotometriás vizsgálattal határozzák meg, és a BAEE-egységek gátlásában fejezik ki.

Egység meghatározása: Egy BAEE egység 0,001 ΔA253 -os ΔA253 -t eredményez percenként pH 7,6 és 25 °C mellett, BAEE-t használva szubsztrátként. Reakció térfogata = 3,2 ml.

Feltételek
Temp = 25 °C, pH = 7,6, A= 253 nm, fényút = 1 cm
Egy 3.2 mL reakciómix végső koncentrációja 63 mM nátrium-foszfát, 0,23 mM Nα-benzoil-L-arginin etil-észter (BAEE), 0,002 mM sósav, 0,005 mg tripszin és 0,003 - 0,001 mg tripszin inhibitor.

Szükséges reagensek
S0751 - Nátrium-foszfát monobázikus
B4500 - Nα-Benzoil-L-arginin etil-észter hidroklorid (BAEE)
258148 - Sósav ACS reagens
T8003 - Trypszin szarvasmarha hasnyálmirigyből
T8003 - Tripsin szarvasmarha hasnyálmirigyből/a>

Reagensek

1. 67 mM nátrium-foszfát puffer, pH 7.6 25 °C-on
   (Készítsen 100 mL-t ionmentesített vízben a Nátrium-foszfát, monobasikus, vízmentes, termékszámmal. S0751. Állítsa be a pH-t 7,6-ra 25 °C-on 1 M NaOH-val.)
2. 0.25 mM Nα-Benzoil-L-arginin etil-észter oldat (BAEE)
   (Készítsen 50 ml-t az a reagensben a Nα-Benzoil-L-arginin etil-észter, hidroklorid, termékszáma. B4500.)
3. 1 mM sósavoldat (HCl)
   (Készítsen 50 ml-t ionmentesített vízben tömény sósav, termékszáma: Szigma, Sigma, Sigma, Sigma, Sigma, Sigma. 258148.)
4. Tripszin enzimoldat (tripszin)
   (Közvetlenül a felhasználás előtt készítsen 1 mg fehérje/ml oldatot, amely tartalmazza az tripszin, termékszáma. T8003, hideg C reagensben.)
5. Tripszin inhibitor oldat (Inhib.)
   (Közvetlenül a felhasználás előtt készítsen 1,0 mg/ml tripszin-inhibitort tartalmazó oldatot hideg A reagensben.)

Eljárás
Pipettázza (milliliterben) a következő reagenseket megfelelő kvarcküvettákba

A rész:

	Uninh	Teszt 1	Teszt 2	Teszt 2	Teszt 3	Teszt 4	Teszt 5
Reagens e (Inhib.)	-	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30
Reagens d (tripszin)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
Reagens c (HCl)	9.50	9.40	9.35	9.30	9.25	9.20

Minimum öt percig, de legfeljebb hat percig hagyjuk állni 25 °C-on.

A következő reagenseket inverzióval keverjük össze és pipettázzuk (milliliterben) a megfelelő küvettákba:

B. rész:

	Uninh	Teszt 1	Teszt 2	Teszt 3	Teszt 2	Teszt 2	Teszt 3	Teszt 4	Teszt 5	Üres
Reagens b (BAEE)		3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
Reagens c (HCl)		0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.20

Keverjük össze inverzióval és egyensúlyozzuk 25 °C-ra. Megfelelően termosztált spektrofotométerrel figyeljük az A_253nm -et, amíg nem állandósul. Ezután adjuk hozzá:

	Uninh (A rész)	0.10	-	-	-	-	-	-	-	-
Teszt 1 (A rész)	-	0.10	-	-	-	-	-		-
Teszt 2 (A rész)	-	-	0.10	-	-	-	-	-
Teszt 3 (A rész)		-	-	-	0.10	-	-	-
4. teszt (A. rész)	-	-	-	-	-	0.10	-	-
5. teszt (A. rész)	-	-	-	-	-	-	0.10	-

Inverzióval azonnal keverjük össze, és kb. 5 percig regisztráljuk az A_253nm -ben bekövetkező növekedést. Határozza meg a ΔA_253nm/perc értéket a tesztek, a vak és a nem gátolt oldat maximális lineáris sebességének felhasználásával.

Kiszámítás

Trypszin aktivitás BAEE egység/mL enzimben =		(0.001)(0.10)(0.5)

df = Hígítási tényező
0,001 = A253nm/perc változás egy egységnyi tripszinben pH 7,6-nál 25 °C-on 3,2 ml reakciómixben
0.10 = A felhasznált enzim térfogata (milliliterben) (B rész)
10.0 = A vizsgálat teljes térfogata milliliterben (A rész)
0.5 = A felhasznált enzim térfogata (milliliterben) (A rész)

Units/mg solid =	egység/mL enzim >mg szilárd/mL enzim

Plot a tripszin aktivitás (BAEE egység/mg fehérje) vs. mL tripszin inhibitor/RM
Mg tripszin inhibitor = (mL tripszin inhibitor)(Koncentrált tripszin inhibitor, mg/mL)

Mg tripszin gátlása 1 mg tripszin inhibitorral =

Normálási tényező = (nem gátolt tripszin BAEE-egységek mg szilárd anyagra/10 000 BAEE-egység tripszin per specifikáció.)

Megjegyzések:

1. Ez az enzimvizsgálat a termékszámok meghatározására szolgál: T9003, T9008., T9128, T9253, T2011, T4385, T4385, T9378, és T0256.
2. Tripszin-inhibitor, II-S típus, termékszám T9128 vizsgálatakor készítsen 0,60 mg/ml tripszin-inhibitort tartalmazó oldatot hideg a reagensben.
3. A gátolatlan tripszin aktivitásnak az aktivitás felszabadulási értékének 85%-án belül kell lennie.
4. A címkénként 11 700-13 005 Trypsin egység/mg szilárd anyaggal a gátolatlan Trypsin reakció aktivitásának elfogadható tartománya 10 000-15 300 Trypsin egység/mg szilárd anyag. Ennek a tartománynak meg kell felelnie egy 0,0545-0,0835 közötti korrigált ΔAbs_253nm/perc értéknek is. Ezzel a sebességgel és 20-80%-os gátlással a ΔAbs_253nm/perc értéknek a spektrofotométer 0,0020-as kimutatási határértéke felett kell lennie.

Tripszin egység átváltások
1 BAEE µM egység = 200 BAEE egység
1 TAME µM egység = 0.27 BAEE µM egység
1 BAEE µM egység = 3,64 TAME egység
1 TAME µM egység = 55 BAEE A253 egység
1 BAEE A253 egység = 0.018 TAME µM egység
1 TAME µM egység = 180 TAME A247 egység
1 TAME A247 egység = 0,33 BAEE egység
1 USP egység = 3,0 BAEE egység
1 NF egység = 1,1 USP egység

Hivatkozások

1. RAWLINGS ND, TOLLE DP, BARRETT AJ. 2004. Evolutionary families of peptidase inhibitors. 378(3):705-716. https://doi.org/10.1042/bj20031825

2. Silverman GA, Bird PI, Carrell RW, Church FC, Coughlin PB, Gettins PGW, Irving JA, Lomas DA, Luke CJ, Moyer RW, et al. 2001. The Serpins Are an Expanding Superfamily of Structurally Similar but Functionally Diverse Proteins. J. Biol. Chem.. 276(36):33293-33296. https://doi.org/10.1074/jbc.r100016200

3. Zhou J, Liu C, Tsou C. 1989. Kinetics of trypsin inhibition by its specific inhibitors. Biochemistry. 28(3):1070-1076. https://doi.org/10.1021/bi00429a022

4. Kennedy AR. 1998. The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as an anticarcinogenic agent. 68(6):1406S-1412S. https://doi.org/10.1093/ajcn/68.6.1406s

5. Huber R, Kukla D, Ruhlmann A, Steigemann W. 1972. Pancreatic Trypsin Inhibitor (Kunitz): Part I: Structure and function. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 36(0):141-150. https://doi.org/10.1101/sqb.1972.036.01.019

6. Pancreatic trypsin inhibitor precursor - Bos taurus (Bovine). [Internet]. Universal Protein Resource (UniProt).[updated 21 Apr 2020; cited 17 Jul 2020]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprot/P00974

7. Stadelman W, Owen C. 1995. Egg Science and Technology. $. New York: Haworth Press Inc..

8. Cooke S, Sampson H. 1997. Allergenic properties of ovomucoid in man. J Immunol.. 159(4):2026-2032.

9. Salahuddin A, Sibghatullah, Baig MA. 1985. Homologous structural domains in chicken egg-white ovomucoid: Characterization and acid denaturation. J. Biosci.. 8(1-2):67-87. https://doi.org/10.1007/bf02703968

10. BEGUM S, SAITO A, XU X, KATO A. 2003. Improved Functional Properties of the Ovoinhibitor by Conjugating with Galactomannan. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67(9):1897-1902. https://doi.org/10.1271/bbb.67.1897

11. GERTLER A, BEN-VALID I. 1980. Stoichiometry of Interaction of Chicken Ovoinhibitor with Pancreatic Trypsin, Chymotrypsin and Elastase I. Eur J Biochem. 110(2):571-577. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04900.x

12. Kinoshita K, Shimogiri T, Okamoto S, Yoshizawa K, Mannen H, Ibrahim HR, Cheng HH, Maeda Y. 2004. Linkage mapping of chickenovoinhibitorandovomucoidgenes to chromosome 13. 35(4):356-358. https://doi.org/10.1111/j.1365-2052.2004.01159.x

13. Song J, Laskowski, M, Qasim MA, Markley JL. 2003. Two Conformational States of Turkey Ovomucoid Third Domain at Low pH:  Three-Dimensional Structures, Internal Dynamics, and Interconversion Kinetics and Thermodynamics?,?. Biochemistry. 42(21):6380-6391. https://doi.org/10.1021/bi034053f

14. KUNITZ M. 1945. CRYSTALLIZATION OF A TRYPSIN INHIBITOR FROM SOYBEAN. Science. 101(2635):668-669. https://doi.org/10.1126/science.101.2635.668

15. Steiner RF, Frattali V. 1969. Purification and properties of soybean protein inhibitors of proteolytic enzymes. J. Agric. Food Chem.. 17(3):513-518. https://doi.org/10.1021/jf60163a001

16. KIM S, HARA S, HASE S, IKENAKA T, TODA H, KITAMURA K, KAIZUMA N. 1985. Comparative Study on Amino Acid Sequences of Kunitz-Type Soybean Trypsin Inhibitors, Tia, Tib, and Tic1. 98(2):435-448. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a135298

17. Steiner R. 1965. The reduction and reoxidation of the disulfide bonds of soy-bean trypsin inhibitor. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 100(1):111-121. https://doi.org/10.1016/0304-4165(65)90433-2

18. Koide T, IKENAKA T. 1973. Studies on Soybean Trypsin Inhibitors. 1. Fragmentation of Soybean Trypsin Inhibitor (Kunitz) by Limited Proteolysis and by Chemical Cleavage. Eur J Biochem. 32(3):401-407. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1973.tb02622.x

19. Bidlingmeyer UDV, Leary TR, Laskowski M. 1972. Identity of the tryptic and ?-chymotrypic reactive sites on soybean trypsin inhibitor (Kunitz). Biochemistry. 11(17):3303-3310. https://doi.org/10.1021/bi00767a028

20. Nanninga L, Guest M. 1964. On the interaction of fibrinolysin (plasmin) with the inhibitors antifibrinolysin and soybean trypsin inhibitor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 108(3):542-551. https://doi.org/10.1016/0003-9861(64)90440-0

21. Ozawa K, Laskowski Jr M. 1966. The reactive site of trypsin inhibitors. J. Biol. Chem.. 241(17):2955-61.

22. R WR, Laskowski Jr. M. 1967. Resynthesis by Trypsin of the Cleaved Peptide Bond in Modified Soybean Trypsin Inhibitor. J. Biol. Chem.. 242(4):771-3.

23. Finkenstadt WR, Laskowski Jr. M. 1965. Peptide Bond Cleavage on Trypsin-Trypsin Inhibitor Complex Formation. J. Biol. Chem.. 240(2):PC962-3.

24. Laskowski M, Laskowski M. 1954. Naturally Occurring Trypsin Inhibitors.203-242. https://doi.org/10.1016/s0065-3233(08)60207-7

25. Kunitz M. 1947. ISOLATION OF A CRYSTALLINE PROTEIN COMPOUND OF TRYPSIN AND OF SOYBEAN TRYPSIN-INHIBITOR. 30(4):311-320. https://doi.org/10.1085/jgp.30.4.311

26. Bowman-Birk type proteinase inhibitor precursor - Glycine max (Soybean). [Internet]. Universal Protein Resource (UniProt).[updated 16 Jun 2020; cited 17 Jul 2020]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprot/P01055

27. Kay E. 1979. Structure-function relationships of proteinase inhibitors from soybean (Bowman-Birk) and lima bean. Modification by N-acetylimidazole. J. Biol. Chem.. 254(16):7648-50.

28. BIRK Y. The Bowman-Birk inhibitor. Trypsin- and chymotrypsin-inhibitor from soybeans. 25(2):113-131. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1985.tb02155.x

29. DiPietro CM, Liener IE. 1989. Heat inactivation of the Kunitz and Bowman-Birk soybean protease inhibitors. J. Agric. Food Chem.. 37(1):39-44. https://doi.org/10.1021/jf00085a010

30. Birk Y. 1976. [59] Lima bean trypsin inhibitors.707-709. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(76)45062-0

31. Nordlund TM, Liu XY, Sommer JH. 1986. Fluorescence polarization decay of tyrosine in lima bean trypsin inhibitor.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83(23):8977-8981. https://doi.org/10.1073/pnas.83.23.8977

32. Kassell B. 1970. [66d] Trypsin inhibitors forom other legumes.862-871. https://doi.org/10.1016/0076-6879(70)19076-8