RT-qPCR neboli kvantitativní PCR s reverzní transkripcí kombinuje účinky reverzní transkripce a kvantitativní PCR nebo PCR v reálném čase za účelem amplifikace a detekce specifických cílů. RT-qPCR má řadu aplikací, včetně kvantifikace úrovně genové exprese, ověřování RNA interference (RNAi), a detekce patogenů, jako jsou viry. Běžnými přístupy k vytváření fluorescenčního signálu používaného k měření množství DNA v této technice je použití buď hydrolyzačních sond, jako jsou sondy TaqMan® nebo barviva vázajícího dvouřetězcovou DNA, jako je barvivo SYBR® Green.
Co je RT-qPCR?
Kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR) zahrnuje detekci a kvantifikaci RNA. Proces probíhá reverzní transkripcí celkové RNA nebo mRNA do komplementární DNA (cDNA) pomocí enzymu reverzní transkriptázy, po níž následuje amplifikace a detekce specifických cílů této cDNA pomocí techniky nazývané kvantitativní PCR (qPCR) nebo PCR v reálném čase. V každém cyklu během této PCR se měří množství DNA v reálném čase pomocí různých fluorescenčních chemikálií. Nejběžnějšími přístupy k vytváření fluorescenčního signálu je použití buď hydrolyzujících sond, jako jsou sondy TaqMan® nebo barviva vázajícího dvouvláknovou DNA, jako je barvivo SYBR® Green.
Výběr fluorescenční chemie závisí na faktorech, jako je aplikace, cena a to, zda se jedná o jednokomplexový nebo multiplexový test. Barviva vázající DNA se upřednostňují pro jednoplexové testy s nízkou kapacitou, protože se snadněji navrhují, mají kratší dobu přípravy a jsou nákladově efektivnější. Fluorescenční sondy se častěji používají ve vysokokapacitních, multiplexních testech, které vyžadují vyšší specifičnost.
Pro více informací o qPCR si prohlédněte náš Technická příručka ke kvantitativní PCR
Použití RT-qPCR
RT-qPCR má řadu aplikací. Technika RT-qPCR se používá k:
- kvantifikaci hladin genové exprese
- ověřování RNAi pro studium ztráty funkce selektivních genů
- detekci patogenů, jako jsou viry, pro diagnostiku infekčních onemocnění
- detekovat geneticky modifikované organismy (GMO)
Jednokrokový test RT-qPCR vs dvoukrokový test RT-qPCR
RT-qPCR se provádí buď v jednom, nebo ve dvou krocích. Při výběru správného druhu metody RT-qPCR je důležité zvážit různé faktory, jako jsou náklady, aplikace a typ testu.
Obrázek 1. Schéma porovnávající jednokrokový pracovní postup RT-qPCR a dvoukrokový pracovní postup RT-qPCR.
Jednokroková RT-qPCR
Při jednokrokové RT-qPCR se reverzní transkripce nebo syntéza cDNA a qPCR provádí v jedné zkumavce za použití sekvenčně specifických primerů pro amplifikaci konkrétního cíle. Geneticky modifikované reverzní transkriptázy se běžně používají v jednostupňových testech, protože snášejí vyšší teploty nezbytné pro žíhání sekvenčně specifických primerů. Jednostupňový test se upřednostňuje při opakované kvantifikaci téhož genu, zejména při vysoce výkonných a diagnostických aplikacích. Dalším hlediskem při výběru jednostupňových testů je kvalita a nedostatek RNA. Vzhledem k tomu, že cDNA syntetizovanou během reakce nelze uložit samostatně jako alikvotní část, může být k opakování testu zapotřebí více vzorků původní RNA.
Dvoukrokový RT-qPCR
Při dvoukrokovém RT-qPCR se reakce reverzní transkripce a qPCR provádějí v samostatných zkumavkách s oddělenými pufry a činidly. Ve dvoukrokových testech lze použít náhodné hexamery, oligo-dT primery a/nebo primery specifické pro daný gen. Oddělené pufry a činidla umožňují větší flexibilitu při výběru enzymů reverzní transkriptázy a činidel pro PCR s více možnostmi optimalizace a zlepšení účinnosti amplifikace obtížných templátů. Stabilnější cDNA syntetizovaná v prvním kroku může být dále koncentrována a/nebo purifikována a buď uložena pro budoucí použití, nebo může být použita pro kvantifikaci více genů ze stejného vzorku.
Podívejte se více na optimalizaci PCR testů v našem Stránka optimalizace a validace testů
Jednofázové RT-qPCR produkty pro vysoce výkonné aplikace
Naše jednokrokové produkty RT-qPCR kombinují účinek reverzní transkriptázy s protilátkou Taq s horkým startem v pohodlných reakčních směsích ReadyMixTM PCR pro aplikace založené na sondách nebo SYBR® Green. Bez ohledu na obtížné sekundární struktury nebo detekční chemii jsou naše reakční směsi ReadyMixTM PCR speciálně vyvinuty tak, aby pomohly dosáhnout vynikajících výsledků v menším počtu kroků.
Naše produkty snadno zapadnou do vašeho pracovního postupu PCR a s řadou spolehlivých produktů pro jednokrokové experimenty RT-qPCR - neuděláte chybnou volbu. Objevte KiCqStart® produkty a najděte master mix ReadyMix™ optimalizovaný pro váš přístroj nebo prozkoumejte naše Možnosti JumpStart™ pro soupravy optimalizované pro vaše experimentální potřeby. Pro vysoce výkonnou, rychlou kvantifikaci RNA v jednom kroku pomocí fluorogenních sond specifických pro danou sekvenci si vyberte Univerzální soupravu KAPA PROBE FAST. S jistotou si vyberte kterýkoli z našich produktů RT-qPCR, aniž byste museli dělat kompromisy v kvalitě.
Jednofázová směs RT-qPCR ReadyMix™ KiCqStart®. - Kompatibilní se všemi hlavními přístroji pro qPCR
Náš KiCqStart je kompatibilní se všemi hlavními přístroji pro qPCR.sup>® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ reagencie se vyznačují přísným mechanismem horkého startu pro větší specifičnost a jsou formulovány tak, aby byly vysoce tolerantní k inhibitorům PCR ve vzorcích. Tyto vysoce citlivé mastermixy připravené k použití jsou navrženy pro pohodlí a obsahují všechny potřebné základní složky pro qPCR nebo RT-qPCR. Stačí přidat primery, sondu a vodu, aby byl testovací koktejl kompletní. Tento produkt je ideální pro rychlou nebo konvenční qPC
Další informace o kompatibilitě přístrojů s těmito produkty najdete v našem Úplná tabulka kompatibility přístrojů nebo si prohlédněte naše Vlastní sondy qPCR.
Směs JumpStart™ Taq ReadyMix™ - Optimalizovatelná pro všechny hlavní qPCR přístroje
Naše směs JumpStart™. Taq ReadyMix™ produkty pro RT-qPCR kombinují výhody reverzní transkriptázy Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV RT) a naší JumpStart™ Taq polymerázy inaktivované protilátkami. Robustní M-MLV RT má schopnost transkribovat přes obtížné sekundární struktury, a to i při zvýšených teplotách, zatímco naše JumpStart™ Taq polymeráza poskytuje větší specifičnost a citlivost než standardní Taq polymeráza. Tyto produkty jsou kompatibilní s přístroji na bázi zkumavek a destiček i s kapilárními přístroji.
Ušetřete 20 % na RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200) použitím kódu SGX při placení. Platí do 31. ledna 2021.
KAPA PROBE FAST - Kompatibilní se všemi technologiemi založenými na fluorogenních sondách
KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix Universal Kit je citlivé a pohodlné řešení pro PCR v reálném čase s použitím RNA jako templátu. Souprava je určena pro vysoce výkonnou, rychle cyklickou, jednostupňovou kvantifikaci RNA pomocí sekvenčně specifických fluorogenních sond. Je kompatibilní se všemi technologiemi založenými na fluorogenních sondách, včetně hybridizačních sond (např. sond s fluorescenčním rezonančním přenosem energie (FRET)), hydrolyzních sond (např. sond TaqMan® a vytěsňovacích sond (např, molekulární majáky).
Tato souprava je koktejl připravený k použití, který obsahuje všechny složky kromě primerů, sondy (sond) a templátu pro rychle cyklickou PCR v reálném čase založenou na sondách. Sada obsahuje KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix, referenční barviva ROX High a ROX Low, KAPA RT Mix a dUTP.
Sada ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit - Kompatibilní se všemi hlavními qPCR přístroji
Reverzní transkriptáza ABScript II v sadě zajišťuje spolehlivou reverzní transkripci RNA. Po reverzní transkripci se při 95 °C aktivuje verze polymerázy Taq s horkým startem a současně se inaktivuje reverzní transkriptáza ABScript II. V sekvenční PCR reakci 5′-3′ exonukleázová aktivita Taq polymerázy rozštěpí hybridizovanou sondu, čímž dojde k oddělení reportéru od zhášedla a uvolnění fluorescenčního signálu.
Sada ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit je sada připravená k použití pro reverzní transkripci a následnou qPCR založenou na sondě v jedné zkumavce. Flexibilní formát této sady obsahuje dvě samostatné 50násobné koncentrace barviva ROX (pasivní reference), které se přidávají podle požadavků konkrétních přístrojů pro qPCR.
Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro použití v diagnostických postupech.
Dvoufázové RT-qPCR produkty pro vyšší flexibilitu
Nabízíme všechna činidla potřebná k provedení reverzní transkripce a následné PCR analýzy syntetizované cDNA v samostatných zkumavkách pro vyšší flexibilitu vašich experimentů. S důvěrou začleňte naše dvoufázové produkty RT-qPCR do svého pracovního postupu PCR, aniž byste museli dělat kompromisy ve flexibilitě. Díky různým možnostem našich spolehlivých produktů pro PCR neuděláte chybnou volbu.
Sady a směsi pro syntézu DNA
Pro splnění vašich potřeb v oblasti reverzní transkripce si můžete vybrat z různých typů enzymů a několika možností balení. Všechny tyto produkty obsahují činidla nezbytná pro syntézu prvního vlákna a jsou k dispozici jako soupravy se samostatnými činidly pro optimalizaci nebo jako kompletní směsi pro rychlou a pohodlnou syntézu prvního vlákna.
Enzymy RT - reverzní transkriptázy
Vyberte si z naší kolekce enzymů RT a najděte ten, který vyhovuje složitosti vašeho transkriptu RNA. Naše produkty zahrnují standardní reverzní transkriptázy viru ptačí myeloblastózy (AMV) a viru myší leukémie (M-MLV), jakož i jejich vylepšené verze pro vyšší citlivost.
Prozkoumejte více o řešení problémů s RT-qPCR v Stránka s řešením problémů s RT-PCR / RT-qPCR.
qPCR soupravy
Tyto ReadyMixTM produkty obsahují všechny potřebné komponenty pro qPCR. Stačí přidat fluorescenční detekční chemikálii, primery a templát.
Probe Based qPCR
Probe Based qPCR spočívá v sekvenčně specifické detekci požadovaného produktu PCR. Na rozdíl od metod qPCR založených na SYBR® Green, které detekují veškerou dvouřetězcovou DNA, využívá qPCR založená na sondě fluorescenčně značenou cílovou specifickou sondu, což vede ke zvýšení specifičnosti a citlivosti. Navíc je k dispozici řada fluorescenčních barviv, takže lze použít více primerů k současné amplifikaci mnoha sekvencí.
SYBR® qPCR na bázi zelené
SYBR® Green I, běžně používané fluorescenční barvivo vázající DNA, váže všechny dvouřetězcové DNA. Detekce se sleduje měřením nárůstu fluorescence v průběhu cyklu. SYBR® Green I má excitační a emisní maxima 494 nm a 521 nm. Specifičnost naší detekce qPCR na bázi SYBR® Green je výrazně zvýšena začleněním polymerázy Taq zprostředkované horkým startem, jako je JumpStart™ Taq.
Zjistěte více o qPCR na bázi SYBR® zelené v tomto krátkém videu.
MikroRNA na bázi RT-qPCR
Vyhledávání a analýza mikroRNA na bázi RT-qPCR
Najděte si produkty pro reverzní transkripci mikroRNA, které potřebujete, v naší řadě produktů MystiCq® .
MystiCq® MicroRNA RT-qPCR SystemR
MystiCq® MicroRNA RT-qPCR SystemR
MystiCq®sup>® reagencie pro mikroRNA poskytují kompletní pracovní postup SYBR® Green RT-qPCR pro kvantifikaci exprese v pouhých třech krocích:
- Izolace
- Syntéza CDNA
- Kvantifikace amplifikací
Další informace o pracovním postupu MystiCq® naleznete na naší stránce produktu MystiCq® . Tyto produkty se vyznačují:
- Více než 1 400 předpřipravených a v mokré laboratoři testovaných párů primerů navržených tak, aby cílily pouze na zralé mikroRNA
- Konverze všech mikroRNA, což umožňuje téměř neomezený počet odečtů z jediného vzorku
- Výběr tří různých produktů pro izolaci mikroRNA /li>
qNávrhy testů PCR a činidel pro výzkum SARS-CoV-2
Snažíme se poskytovat výzkumníkům spolehlivé zdroje a nástroje na podporu boje proti COVID-19 (SARS-CoV-2). V reakci na potřebu komunity po specifických činidlech a protokolech pro SARS-CoV-2 naši vědci vyhodnotili soupravy One-Step RT-qPCR na bázi RNA pro detekci cíle SARS-CoV-2. Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro použití v diagnostických postupech.
Experimentální design a metody
Tento experiment byl proveden s cílem zjistit, zda naše soupravy One-Step RT-qPCR mohou detekovat SARS-CoV-2. Test byl proveden podle protokolu CDC pro detekci SARS-CoV-2 s použitím syntetizované RNA SARS-Cov-2 jako templátu, zředěné na 105, 104, 103, 102 a 10 kopií. Testovací vzorek obsahoval templát, činidla z každé soupravy, cílově specifické DNA primery /TaqMan® sady sond pro N1 a N2 (N, nukleokapsidový gen). Do každého testu byly zahrnuty také vzorky NTC (kontrola bez templátu).
Tabulka 2. Sady primerů a sond určené pro specifickou detekci SARS-CoV-2 (testy N1 a N2). Pouze pro výzkumné použití. Není určeno k použití při diagnostických postupech.
Výsledky testů
A: test N1
B: Test N2
Obrázek 2. Testy detekce SARS-CoV-2 s použitím kvantitativní směsi RT-PCR ReadyMix™ (kat. č. QR200) pro cíle primerů N1 (graf A) a N2 (graf B).
Testy detekce SARS-CoV-2 N1 (graf A) a N2 (graf B) na obrázku 2 byly provedeny pomocí směsi Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (kat. č. QR200) s použitím syntetizované SARS-CoV-2 RNA jako templátu. Oba testy vykazovaly citlivost na detekci již 102 kopií templátu. U vzorků NTC nebyla pozorována žádná amplifikace
A: Test N1
B: Test N2
Obrázek 3. Testy detekce SARS-CoV-2 s použitím KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (kat. č. KCQS07) pro cíle primerů N1 (graf A) a N2 (graf B).
Testy detekce SARS-CoV-2 N1 (graf A) a N2 (graf B) na obrázku 3 byly provedeny pomocí směsi KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Cat. No. KCQS07) s použitím syntetizované SARS-CoV-2 RNA jako templátu. Oba testy vykazovaly citlivost na detekci již 10 kopií templátu. U vzorků NTC nebyla pozorována žádná amplifikace.
A: Test N1
B: Test N2
Obrázek 4. Testy detekce SARS-CoV-2 s použitím univerzální sady KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) (kat. č. KK4752) pro cíle primerů N1 (graf A) a N2 (graf B).
Testy detekce SARS-CoV-2 N1 (graf A) a N2 (graf B) na obrázku 4 byly provedeny pomocí univerzální sady KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) (kat. č. 4). No. KK4752) s použitím syntetizované SARS-CoV-2 RNA jako templátu. Oba testy vykazovaly citlivost na detekci již 102 kopií templátu. U vzorků NTC nebyla pozorována žádná amplifikace.
A: Test N1
B: Test N2
Obrázek 5. Testy detekce SARS-CoV-2 s použitím sady ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (kat. č. RK20407) pro cíle primerů N1 (graf A) a N2 (graf B).
Testy detekce SARS-CoV-2 N1 (graf A) a N2 (graf B) na obrázku 5 byly provedeny pomocí sady ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (kat. No. RK20407) s použitím syntetizované SARS-CoV-2 RNA jako templátu. Oba testy vykazovaly citlivost na detekci již 10 kopií templátu. U vzorků NTC nebyla pozorována žádná amplifikace.
Závěr
Výše uvedené výsledky naznačují, že naše činidla a soupravy One-Step RT-qPCR jsou ideální pro detekci cíle SARS-CoV-2 ve výzkumu SARS-CoV-2. Na základě těchto informací mohou testy využívající činidla One-Step RT-qPCR detekovat již 100 kopií nebo v některých případech až 10 kopií RNA templátu.
Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro použití v diagnostických postupech.
Nepublikované údaje uvedené v tomto technickém článku pocházejí z interního výzkumu.
Další informace o produktech RT-qPCR pro detekci SARS-CoV-2 naleznete na Sigma-Aldrich.com/covid19
TRI Reagent® pro izolaci celkové RNA
TRI Reagent® je ideální pro rychlou, ekonomickou a účinnou izolaci celkové RNA nebo současnou izolaci RNA, DNA a proteinů ze vzorků lidského, živočišného, rostlinného, kvasinkového, bakteriálního a virového původu.
Tento produkt, směs guanidin-tiokyanátu a fenolu v monofázovém roztoku, účinně rozpouští DNA, RNA a bílkoviny při homogenizaci nebo lýze vzorku tkáně. Po přidání chloroformu nebo 1-brom-3-chlorpropanu a odstředění se směs rozdělí na 3 fáze: vodnou fázi obsahující RNA, interfázi obsahující DNA a organickou fázi obsahující proteiny. Po oddělení fází lze izolovat každou složku. Jeden ml přípravku TRI Reagent® stačí k izolaci RNA, DNA a bílkovin z 50-100 mg tkáně, 5-10 ´106 buněk nebo 10 cm2 povrchu kultivační misky pro buňky pěstované v monovrstvě.
Jedná se o jednu z nejefektivnějších metod izolace celkové RNA, kterou lze dokončit za pouhou 1 hodinu a začít s čerstvou tkání nebo buňkami. Postup je velmi účinný pro izolaci molekul RNA všech typů o délce 0,1-15 kb. Výsledná RNA je neporušená, s malým nebo žádným množstvím kontaminující DNA a bílkovin. Lze jej použít pro Northern bloty, izolaci mRNA, in vitro translaci, test ochrany proti RNáze, klonování a PCR.
Reagencie TRI® byla v několika výzkumných studiích široce používána při inaktivaci virů a extrakci virové RNA pro detekci SARS-CoV-2 pomocí testů RT-qPCR.1, 2, 3 Ukázalo se, že je ideální pro izolaci a skladování mi-RNA při -800C po delší dobu.4 Byla použita při extrakci RNA kočičích a psích koronavirů, která se dále používá v RT-PCR testu.5, 6 Byla také použita k izolaci cytoplazmatické RNA z buněk Vero infikovaných SARS-CoV. 7
Pouze pro výzkumné účely. Není určeno k použití při diagnostických postupech.
Odkazy
*Tento článek je preprint a nebyl recenzován. Informuje o novém lékařském výzkumu, který ještě nebyl vyhodnocen, a proto by neměl být používán jako vodítko pro klinickou praxi.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?