Bioluminiscenční testy světlušky luciferázy

Co je světluška luciferáza?

Světluška luciferáza je široce používaný bioluminiscenční reportér pro studium regulace a funkce genů. Jedná se o velmi citlivý genetický reportér díky absenci endogenní aktivity luciferázy v buňkách savců nebo tkáních. Světluška luciferáza je 62 000 daltonů velký protein, který je aktivní jako monomer a pro svou aktivitu nevyžaduje následné zpracování. Enzym katalyzuje ATP-dependentní oxidaci D-luciferinu na oxyluciferin, čímž vzniká světelná emise se středem při vlnové délce 560 nm. Světlo emitované reakcí je přímo úměrné počtu molekul enzymu luciferázy.

Obrázek 1. Princip testu luciferázy. Bioluminiscenční reakce katalyzovaná světluškou luciferázou produkuje světlo.

Jaký je rozdíl mezi bioluminiscencí a fluorescencí?

Bioluminiscence je chemický proces, při kterém enzym rozkládá substrát (například luciferázu a D-luciferin) a jedním z vedlejších produktů této reakce je světlo. Bioluminiscence se v přírodě přirozeně vyskytuje u různých řas, bakterií, hub a některých vodních živočichů, například medúz. Fluorescence je fyzikální proces, při kterém světlo excituje elektrony ve fluoroforu do vyššího energetického stavu, a když tento elektron klesne zpět do základního stavu, vyzáří foton.

Jak fungují testy luciferázy?

Luciferázové testy (SCT151, SCT154, LUC1, LUCASSY-RO) jsou určeny pro jednoduchou a účinnou kvantifikaci aktivity reportérového enzymu světlušky luciferázy z kultivovaných buněk s vysokou citlivostí a linearitou. Jedná se o luminiscenční test zábleskového typu, který vyžaduje měření signálu ihned po přidání pracovního roztoku ke vzorkům. Luminiscenční signál se rozpadá v průběhu přibližně 10 minut reakční doby, ačkoli poločas rozpadu signálu se může lišit v závislosti na úrovni exprese luciferázy.

Tvorba světla v důsledku luciferázové reakce vede k tvorbě sebevražedného adenyl-oxyluciferinu na povrchu enzymu. To má za následek velmi krátký poločas světelné emise s kinetikou bleskového typu. Test Firefly Luciferase HTS Assay (SCT150) je navržen s patentovanou směsí látek, které modifikují enzymatickou reakci tak, aby vytvářela dlouhotrvající signál (steady-glow) tím, že zabraňuje tvorbě adenyl-oxyluciferinu na povrchu enzymu. Jedná se o homogenní vysoce citlivou soupravu pro testování reportérového genu světlušky luciferázy pro kvantifikaci exprese světlušky luciferázy v savčích buňkách s poločasem rozpadu signálu přibližně 3 hodiny (obrázek 2). Testy se svítící luciferázou mají nižší luminiscenční signál ve srovnání s testy typu flash. Citlivost a mez detekce testu závisí na úrovni exprese luciferázy ve vašem experimentálním systému a také na citlivosti luminometru.

Obrázek 2. Titrace rekombinantní světluščí luciferázy v testu světluščí luciferázy. A) Rekombinantní luciferáza byla sériově ředěna v 1X Firefly Lysis Buffer s 1 Mg/ml BSA a měřena v testu. B) Firefly Luciferase HTS Assay je souprava pro testování reportérového genu firefly luciferázy s ustáleným svícením a vysokou citlivostí pro kvantifikaci exprese firefly luciferázy v savčích buňkách s poločasem rozpadu signálu přibližně 3 hodiny.

Jaký je rozdíl mezi světluškou a Renilla luciferázou?

Při testech s luciferázou Firefly se k produkci světla (zelené/žluté, 550-70 nM) používá luciferin v přítomnosti kyslíku, ATP a hořčíku, zatímco Renilla luciferázový test (SCT153) vyžaduje k produkci světla pouze koelenterazin a kyslík (modrá, 480 nM). Renilla luciferáza se používá jako reportérový gen pro studium regulace a funkce genů in vitro a in vivo. Běžně se používá v multiplexních transkripčních reportérových testech nebo jako normalizační kontrola transfekce pro testy světluščí luciferázy. Enzym nevyžaduje pro svou aktivitu posttranslační modifikaci a může fungovat jako genetický reportér bezprostředně po translaci. Coelenterazin, substrát pro Renilla luciferázu, také vyzařuje světlo z oxidace nezávislé na enzymu, což je proces známý jako autoluminiscence. Autoluminiscence je v buňkách a tkáních zesílena superoxidovým aniontem a peroxynitritem.     

Obrázek 3. Světluška vs. Renilla Luciferáza. Bioluminiscenční reakce katalyzované světluščí luciferázou a Renilla luciferázou.

Jaké jsou výhody duálních luciferázových testů?

Dvojitá luciferázová zkouška Firefly/Renilla (SCT152).) umožňuje měření aktivity jak Firefly, tak Renilla luciferázy ve stejném vzorku s vysokou citlivostí a linearitou. Nejprve se změří aktivita světlušky luciferázy, poté se přidá Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0, aby se současně uhasila aktivita světlušky luciferázy a změřila aktivita Renilla luciferázy. Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0 zháší aktivitu světlušky luciferázy na úroveň netransfekovaných buněk, což umožňuje postupné měření aktivity světlušky a Renilla luciferázy ve stejném vzorku. Jedná se o test zábleskového typu, který vyžaduje měření luminiscence ihned po přidání detekčních činidel ke vzorku luciferázy. Signál světlušky se rozpadá v průběhu přibližně 12 minut, zatímco signál Renilly se rozpadá v průběhu přibližně 2 minut, i když se to může lišit v závislosti na hladinách enzymu.

Obrázek 4. Přehled duálních luciferázových testů. Příklad detekce světluščí a renilla luciferázy pomocí lyzátů z netransfekovaných HeLa buněk nebo buněk transfekovaných buď pouze světluščí luciferázou (Firefly Only), nebo ko-transfekovaných světluščí a renilla luciferázou (Firefly + Renilla). U buněk transfekovaných pouze světluškou je signál Renilla zbytkovou luminiscencí světlušky po přidání pracovního roztoku Renilla do reakce.

Jaké jsou aplikace luciferázových testů?

• Genový reportér

  Genové reportéry se používají jako indikátory pro studium buněčných dějů spojených s genovou expresí. Obvykle se reportérový gen klonuje se zájmovou sekvencí DNA do expresního vektoru (který nese gen pro luciferázu), který se pak přenáší do buněk. Po přenosu se v buňkách zjišťuje přítomnost reportéru přímým měřením samotného reportérového proteinu nebo enzymatické aktivity luciferázy. Dobrý reportérový gen lze snadno identifikovat a kvantitativně měřit, když je exprimován (v organismu nebo buňkách, které jsou předmětem zájmu).

  Například společnosti Sigma a SwitchGear Genomics™ se spojily, aby exkluzivně nabídly kolekci více než 10 000 genomových oblastí 3′UTR v našem optimalizovaném systému lentivirových luciferázových reportérových vektorů. Při provádění experimentů pomocí MISSION^®3′UTR Lenti GoClones, včetně vhodných kontrol umožňuje přesnou interpretaci výsledků experimentální genové exprese.

• Životaschopnost buněk pomocí detekce ATP

  Protože ATP je indikátorem metabolicky aktivních buněk, lze počet životaschopných buněk hodnotit na základě množství dostupného ATP. Test životaschopnosti buněk pomocí ATP luciferázy (SCT149, 11699709001) nabízí vysoce citlivý homogenní test pro kvantifikaci ATP v buněčných kulturách. Tato souprava využívá využití ATP světluškou luciferázou k oxidaci D-Luciferinu a výsledné produkce světla k posouzení množství ATP dostupného v buněčných kulturách. Citlivý postup testu zahrnuje jednorázové přidání koktejlu pro detekci ATP přímo do buněk kultivovaných v médiu doplněném sérem. Není nutné promývání buněk, odstraňování média a opakované pipetování. Souprava může být použita k detekci pouhé jedné buňky nebo 0,01 pikomolů ATP. Vytvořený signál je lineární v rozsahu 6 řádů. Díky vztahu množství ATP k počtu životaschopných buněk má test široké využití, od stanovení počtu životaschopných buněk přes buněčnou proliferaci až po buněčnou cytotoxicitu.

Obrázek 5. Test životaschopnosti buněk ATP. Využití ATP světluškou luciferázou k oxidaci D-luciferinu a výsledná produkce světla k posouzení množství dostupného ATP, které koreluje s počtem buněk a jejich životaschopností.

• In vivo zobrazování

  Bioluminiscenční zobrazování (BLI) se stalo oblíbenou technikou optického sledování buněk u malých laboratorních zvířat, jako jsou myši. Spolu s nízkou autofluorescencí pozadí a buněčnou toxicitou může BLI umožnit současné vizuální sledování exprese dvou odlišných luciferázových proteinů pomocí jejich specifických substrátů. Zobrazování aktivity dvou luciferázových genů (červené luciferázy optimalizované pro kodon světlušky a zelené luciferázy klikoroha) u stejných zvířat by mohlo snížit odchylky vyplývající z individuálních rozdílů pokusných zvířat.