Polysacharidy značené FITC

FITC-Dextran
FITC-DEAE-dextran (FDD)
FITC-karboxymethyl-dextran (FCM-Dextran)
FITC-polysukróza (FITC-Ficoll^®)
FITC-DEAE-polysukróza
FITC-DEAE-polysukróza
FITC-CM-polysukróza (FITC-CM-Ficoll^®)
FITC-inulin
Fluoresceinová kyselina hyaluronová (FHA-Se)
TRITC-značené polysacharidy
TRITC-polysukróza (TRITC-Ficoll^®)
Polysukróza (TRITC-Ficoll^®)
Tetrametyl-rhodaminová kyselina hyaluronová (TR-HA)
Reference

FITC-Dextran

Fluorescein isothiokyanát dextran

Chemické názvy:
Dextran(3´,6´dihydroxy-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H),9´-[9H]xanthen]-5(nebo 6)-yl)karbamothioát.
Fluorescein isothiokyanát-dextran.
Fluoresceinyl thiokarbamoyl-dextran.

Číslo CAS: 60842-46-8

Struktura

Definice
M_w: M_n: DS: průměrná početní průměrná molekulová hmotnost
DS: Definuje počet substitučních molekul na jednu molekulu glykosy v polysacharidovém řetězci

Vlastnosti

Vybrané frakce dextranu připravené z nativního dextranu B512F jsou značené fluoresceinem pomocí stabilní thiokarbamoylové vazby - postup značení nevede k žádné depolymerizaci dextranu¹. DS FITC-dextranů se pohybuje v rozmezí 0,002-0,008 a při těchto nízkých úrovních substituce propůjčuje dextranům minimální náboje, což je důležité pro studie propustnosti.

FITC-dextran se dodává jako žlutooranžový prášek, který se volně rozpouští ve vodě nebo v roztocích solí a vytváří žlutý roztok. Produkt se také rozpouští v DMSO, formamidu a některých dalších polárních organických rozpouštědlech, ale je nerozpustný v nižších alifatických alkoholech, acetonu, chloroformu, dimethylformamidu. Frakce s vysokou molekulovou hmotností by se měly rozpouštět pomalým přidáváním prášku do teplé vody (přibližně 60 °C) za intenzivního míchání.

Molekula dextranu s molekulovou hmotností vyšší než 5 000 daltonů se v roztoku chová jako pružná a protáhlá spirála. Tabulka 1 ukazuje molekulové rozměry při různých molekulových hmotnostech. Dextrany a FITC-dextrany vykazují newtonovské tokové charakteristiky, tj. viskozita nezávisí na smykové rychlosti.
 

Tabulka 1 Molekulární rozměry dextranu.

Dextran (Mw)	Stokesův poloměr (Å)	Gyrační poloměr (Å)
2 x 106	270	380
1 x 106	199	275
500 000	147	200
200 000	130	130
100 000	69	95
70 000	58	80
40 000	44.5	62
10 000	23,6	-

Spektrální data

Obrázek 1. Fluorescenční skenování FITC-dextranu 70 v 0,025M boritanu pH 9,0 ( 10 mg v 50 ml pufru). Excitace 495 nm; emise 520 nm.

Obrázek 2. Fluorescence (emise 520 nm) FITC-dextranu v rozmezí pH 4-9

Skladování a stabilita

Stabilita FITC-dextranů in vitro a v případech, kdy je FITC-dextran v přípravku FITCin vivo je vynikající - pouze při zvýšeném pH(>9) a zvýšených teplotách hrozí hydrolýza fluoresceinové značky. Studie při teplotě 37 °C

v králičí plazmě, svalovém homogenátu, jaterním homogenátu a moči prokázaly, že FITC-dextrany jsou stabilní po dobu nejméně 3 dnů². Nebyly zaznamenány žádné změny Mw. ani uvolňování fluoresceinových částí. FITC-dextran je stabilní v 6% kyselině trichloroctové při pokojové teplotě po dobu 3 dnů². Autoklávované roztoky FITC-dextranu 70 byly skladovány při teplotách od 8 do 50 °C po dobu až 5 měsíců. Pouze vzorky skladované při 50 °C vykazovaly mírný nárůst (1 %) volného aminofluoresceinu. Bylo zjištěno, že FITC-dextran je stabilní při pH 4, ale při pH 9 došlo při teplotě 35 °C během 1 měsíce ke značnému (24%) poklesu fluorescence. Několik studií³ potvrdilo in vivo stabilitu FITC-dextranů během pokusů (1-6 dní) .

Použití

FITC-dextrany se používají především ke studiu propustnosti a transportu v buňkách a tkáních, ale lze je použít i ke studiu propustnosti jiných materiálů (filtrů, gelů atd.). Zvláštní výhodou je, že měření fluorescence poskytuje kvantitativní údaje o propustnosti zdravých a nemocných tkání v reálném čase. Intravitální fluorescenční mikroskopie nabízí vysokou citlivost a ve tkáňových tekutinách lze detekovat koncentrace až 1 μg/ml. Bylo vyvinuto několik modelů pro usnadnění studií v reálném čase^4,5 FITC-dextrany byly také použity jako pH sonda v buňkách^6,7. Z polarizačních experimentů bylo také zjištěno, že doba života excitovaného stavu je podobná době života před konjugací .

FITC-dextrany se ukázaly jako cenné v následujících oblastech studia (odkazy vybrané z rozsáhlého seznamu k jednotlivým tématům):

1. Studie propustnosti střevních tkání^8-10
2. Studie propustnosti mozku a nervového systému^11-13
3. Studie propustnosti nádorových tkání^14-16
4. Studie propustnosti v oční komoře^17-19
5. Studie propustnosti tkání ledvin²⁰

Obrázek 3. Snímky pořízené z lícního vaku po infuzi FITC-dextranu 150. Druhý snímek ukazuje prosakování mikrovaskulatury po působení histaminu. (foto se svolením E. Svensjö).

 

FITC-DEAE-Dextran (FDD)

Chemické názvy:

FITC-Diethylaminoethyl-dextran
Fluorescein-thiokarbamoyl-(O-2-diethylaminoethyl)-dextran
./p>

Číslo CAS;  není k dispozici

Struktura

Vlastnosti

FITC-DEAE-dextrany se dodávají ve formě žlutého prášku, který je volně rozpustný ve vodě nebo roztocích elektrolytů. Rychlost rozpouštění závisí na velikosti a struktuře částic a doporučuje se prášek přidávat pomalu za intenzivního míchání - u vysokomolekulárních produktů lze vodu zahřát. DS(FITC) se pohybuje v rozmezí 0,001 - 0,008 a mezní hodnoty obsahu dusíku jsou 3 - 5 % - což odpovídá přibližně jednomu DEAE-substituentu na tři glukózové jednotky. Syntéza zavádí do dextranového řetězce dva typy DEAE-substituentů (viz struktura výše). Převládajícím substituentem je jedna terciární skupina, která však dále reaguje zejména při vyšších DS za vzniku "tandemové" skupiny obsahující kromě terciárního aminu také kvartérní amin.

Spektrální údaje

 

Obrázek. 4. Fluorescenční skenování FITC-DEAE-dextranu v 0,025M boritanu pH 9,0 (10 mg v 50 ml pufru). Excitace 495 nm; emise 520 nm.

Skladování a stabilita

Prášek je stabilní při pokojové teplotě po dobu delší než tři roky, pokud je skladován v dobře uzavřených nádobách ve tmě. V roztoku by FITC-DEAE-dextran neměl být delší dobu skladován při pH>8.

Použití

FITC-DEAE-dextran bude mít mnoho vlastností, které vykazují mateřské DEAE-dextrany, ale bude také vykazovat fluorescenci, aby bylo možné jej sledovat. Některé aplikace DEAE-dextranů jsou uvedeny níže:-

• Jako adjuvans pro vakcíny 
• Zlepšuje vychytávání bílkovin a nukleových kyselin buňkami - transfekční techniky a virová infekčnost 
• Pro stabilizaci proteinů (enzymů)

FITC-DEAE-dextrany byly použity ke studiu doručování kladně nabitých molekul do jaderných buněk prostřednictvím perforinového póru²¹. Ve studii promotorů absorpce²² byla porovnávána propustnost FITC-DEAE-dextranů, FITC-dextranu a FITC-dextran sulfátu nosní sliznicí.

 

FITC-karboxymethyl-dextran (FCM-Dextran)

Chemické názvy:

FITC-karboxymethyl-dextran
Fluorescein-thiokarbamoyl-(O-karboxymethyl)-dextran

Číslo CAS;  není k dispozici

Struktura

Vlastnosti

FITC-CM-dextrany se vyrábějí reakcí vybraných frakcí dextranu s aktivovaným karboxymethylderivátem v alkáliích, přičemž O-karboxymethylové skupiny se zavádějí podél řetězce dextranu. Obsah karboxylu je přibližně 5 %, což odpovídá přibližně jedné CM skupině na každých pět glukosových jednotek. Poté se reakcí s fluorescein isothiokyanátem zavedou fluoresceinové skupiny. DS(FITC) se pohybuje mezi 0,003 a 0,008. FITC-CM-dextrany se dodávají jako žlutý prášek, který je volně rozpustný ve vodě nebo v roztocích elektrolytů. Produkty mají výrazný polyaniontový charakter díky připojeným záporně nabitým karboxylovým skupinám. Očekává se, že vlastnosti roztoku FITC-CM-dextranů budou srovnatelné s vlastnostmi CM-dextranů^23-25. V neutrálních roztocích se karboxymethyl substituenty vzájemně odpuzují, což vede k expanzi dextranové spirály. FITC-CM-dextrany jsou nerozpustné ve většině organických rozpouštědel, například v ethanolu, methanolu, acetonu, chloroformu, ethylacetátu.

Spektrální údaje

Obrázek. 5. Fluorescenční skenování FITC-CM-dextranu v 0,025M boritanu pH 9,0 (10 mg v 50 ml pufru). Excitace 493 nm; emise 519 nm.

Skladování a stabilita

Prospektivní studie stability prokázaly, že CM-dextrany si zachovávají svou účinnost a čistotu po dobu nejméně 3 let (nepublikované studie), a na základě našich zkušeností s FITC-dextrany předpokládáme podobnou stabilitu i u FITC-CM-dextranů. Doporučuje se skladovat FITC-CM-dextrany ve vzduchotěsných obalech ve tmě při pokojové teplotě.

Použití

Zjistilo se, že samotný CM-dextran je biokompatibilní a používá se jako výchozí materiál v několika farmaceutických a diagnostických aplikacích. Stejně tak se předpokládá, že toxicita FITC-CM-dextranu je rovněž nízká. Vložení karboxylové skupiny do dextranového řetězce poskytuje další možnosti imobilizace molekul se zajímavou biologickou aktivitou (léčiva, enzymy, diagnostické stopovací látky) na dextran. karboxylovou část lze použít v mnoha reakcích, například esterifikaci, amidaci s aminy, UGI nebo Passeriniho reakcích. Jednoduché iontově vazebné reakce mohou také poskytnout řadu derivátů zahrnujících různé kationtové molekuly^26,27. Karboxylové skupiny také dodají molekule celkový záporný náboj, což může být cenné pro získání informací o vlastnostech propustnosti buněčných membrán a tkání²⁸. Bylo zaznamenáno použití FITC-CM-dextranu při studiu systémů pro podávání léčiv²⁹.

 

FITC-Polysucrose (FITC-Ficoll^®)

Chemical Names:

Polysukróza(3´,6´dihydroxy-3-oxospiro(isobenzofuran -1(3H),9´-[9H]xanthen]-5
(nebo 6)-yl)karbamothioát.br> Fluorescein isothiokyanát-polysukróza

Číslo CAS;  není k dispozici

Struktura:

Vlastnosti

Frakce polysacharidů se značí fluoresceinem postupem podobným tomu, který popsali de Belder a Granath¹. Fluoresceinová část je připojena stabilní thiokarbamoylovou vazbou a postup značení nevede k žádné depolymeraci polysukrosy. DS FITC-polysukrosy se pohybuje v rozmezí 0,001- 0,008 a při těchto nízkých hladinách substituce propůjčuje polysukrose minimální náboje.

FITC-polysukrose se dodává jako žlutý prášek, který se volně rozpouští ve vodě nebo v roztocích solí za vzniku žlutého roztoku. Produkt se také rozpouští v DMSO, formamidu a některých dalších polárních organických rozpouštědlech, ale je nerozpustný v nižších alifatických alkoholech, acetonu, chloroformu a dimethylformamidu.

Molekula polysukrosy se v roztoku chová jako kulovitá molekula, což lze očekávat z její struktury. Srovnání Stokesova poloměru frakcí dextranu a polysukrosy odráží tyto rozdíly v molekulární flexibilitě (tabulka 2). Molekulu lze nejlépe považovat za mezistupeň mezi tvrdou pevnou koulí a pružnou spirálou. Proto při porovnávání polysukrosových a dextranových frakcí s podobnou molekulovou hmotností budou molekulové rozměry polysukrosy vždy menší. Roztoky polysacharózy mají velmi nízký osmotický tlak ve srovnání s roztoky sacharózy o stejné koncentraci. Tak má 10% roztok polysukrosy 70 osmolalitu 3 mOs/kg ve srovnání se 150 pro 10% sacharózu.

Nebyly publikovány žádné podrobné studie toxicity FITC-polysukrosy. Frakce polysukrózy (100 000 až 500 000) však při intravenózním podání v dávkách až 12 g/kg u pokusných zvířat nevykazovaly žádné toxické příznaky. Polysukróza vykazuje vynikající biokompatibilitu s buňkami, viry, mikroorganismy atd. a již po mnoho desetiletí se používá v technologii separace buněk.

Tabulka 2 Srovnání molekulárních rozměrů polysukrózy a dextranu

Mw	Polysukróza Stokesův poloměr (Å)	Dextran Stokesův poloměr(Å)
2 x 106	-	Podle tohoto vzorce se vypočítá průměrná hodnota.270
1 x 106	Podíl: 270
1 x 106	140	199
500 000	106	147
200 000	Podíl 0,5 % z celkového počtu obyvatel.74	95
100 000	Podle údajů v tabulce se jedná o částku, která se vztahuje na 100 000	.55	69
70 000	49.5	58
40 000	40	44.5
10 000	-	23,6

Spektrální data

Obrázek 6. Fluorescenční skenování FITC-polysukrózy70 v 0,025M boritanu pH 9,0 (9,9 mg v 50 ml pufru). Excitace 496 nm; emise 525 nm. Měření v biologických médiích může významně ovlivnit intenzitu fluorescence, která může být zvýšená nebo snížená.

Skladování a stabilita

Prášek polysacharidu FITC je při skladování ve vzduchotěsných obalech při teplotě okolí stabilní nejméně 6 let. Stabilita FITC-polysukrosy v roztoku nebyla podrobně zkoumána. Nicméně stabilita thiokarbamoylové vazby mezi fluoresceinovou částí a polysukrózou bude podobná jako u dextranu (viz FITC-dextran). FITC-dextran je stabilní při pH 4 po dobu až 1 měsíce při teplotách do 35 °C, ale to nelze doporučit pro výrobky na bázi polysukrosy vzhledem k labilitě glykosidických vazeb v sacharóze. Polysukrózu samotnou lze autoklávovat při neutrálním a mírně alkalickém pH.

Použití

Dostupné údaje o dvou polysacharidech, polysukrose (Ficoll^®) a dextranu, pro hodnocení glomerulární permselektivity ve srovnání s glomerulárními proteiny byly přezkoumány³⁰. Polydisperzní polysacharidy jsou vynikajícími sondami pro měření glomerulární permselektivity a jsou reprodukovatelné, spolehlivé a elegantní. Autoři se podrobně zabývají různými vlastnostmi, které mohou ovlivnit výsledky, jako je velikost molekul, tvar, náboj a flexibilita, a hodnotí jejich výsledek v různých modelech pórů. Studie glomerulární permeability ficollu při intravenózní infuzi ukázaly, že má mezní hodnotu přibližně 50Å, zatímco dextran se vylučuje až do 60-70Å - to se vysvětluje větší flexibilitou dextranu. Clearance FITC-polysukrosy u myší, kterým chybí endoteliální kavely, byla studována za účelem objasnění makromolekulárních transportních cest³¹. Glomerulární filtr byl studován při různých rychlostech glomerulární filtrace pomocí FITC-polysukrózy 70 a 400 (také FITC-inulinu)³².

Studie glomerulární filtrace dextranu a ficollu ukázaly, že glomerulární membrána představuje mnohem restriktivnější bariéru pro ficoll než pro dextran³³ . Zajímavé je, že hodnoty koeficientu sítování pro Ficoll se blížily hodnotám uváděným pro nenabité globulární proteiny. Glomerulární sítování u potkanů po operaci a svalovém traumatu bylo sledováno pomocí FITC-polysukrózy 70/400³⁴. Potkanům byla podána směs FITC-polysukrózy 400 (960 μg), FITC-polysukrózy 70 (40 μg) a FITC-inulinu (500 μg) jako priming bolus. Glomerulární permeabilita byla studována u myší s knockoutem kaveolinu-1 pomocí FITC-polysukrózy 70/400³⁵.

FITC-polysukróza 70 a albumin byly infundovány potkanům za účelem zkoumání vlivu teploty a chloridu amonného na frakční clearance. Polysukróza se chová jinak než dextrany a její clearance byla nižší v rozmezí 20-70 Å^36,37. FITC-polysukróza 70 byla použita k posouzení, zda zvýšení clearance nativního albuminu po 9 týdnech diabetu bylo způsobeno sníženou nábojovou selektivitou nebo změnou podílu velkých pórů³⁸.

 

FITC-DEAE-Polysucrose

Chemické názvy:

FITC-(O-diethylaminoethyl)-polysukrose
Fluoresceinyl-thiocarbamoyl-(O-diethylaminoethyl)-polysukrose
FITC-(O-diethylaminoethyl)-polysukrose
/p>

Číslo CAS;  není k dispozici

Struktura:

Vlastnosti

FITC- DEAE-polysukróza se dodává jako žlutý prášek, který je snadno rozpustný ve vodě nebo pufrovacích roztocích a na každých pět hexosových skupin připadá přibližně jedna skupina DEAE. Limity pro stupeň substituce FITC jsou 0,001 až 0,008. Produkt má polykationtový charakter. Jak je znázorněno na výše uvedeném strukturním znázornění, DEAE-substituenty mohou být přítomny buď jako jedna jednotka, nebo jako "tandemová" jednotka - ta druhá obsahuje kvartérní amoniovou strukturu.

Spektrální údaje

Excitace se nejlépe provádí při 493 nm a fluorescence se měří při 523 nm (obrázek 7). Měření v biologických médiích může výrazně ovlivnit intenzitu fluorescence, která může být zvýšena nebo snížena.

Obrázek 7. Fluorescenční skenování FITC-DEAE-polysukrózy 70 v 0,025M boritanu pH 9,0 (10 mg v 50 ml pufru). Excitace 496 nm; emise 530 nm. Měření v biologických médiích může významně ovlivnit intenzitu fluorescence, která může být zvýšená nebo snížená.

Skladování a stabilita

FITC-DEAE-polysukróza se dodává jako suchý žlutý prášek a měla by se skladovat v dobře uzavřených nádobách při pokojové teplotě ve tmě. pH produktu při dodání je 6,5 - 7,0 a nemělo by klesnout pod pH 5. Produkt by neměl být skladován při pH > 7,0 po delší dobu.

Použití

Produkt se používá ke studiu propustnosti polykationtových polymerů ve vztahu k neutrálním polymerům v orgánech, tkáních a buňkách.

 

FITC-CM-Polysucrose (FITC-CM-Ficoll^®)

Chemical Names:

FITC-(O-karboxymethyl)-polysucrose
Fluoresceinyl-thiokarbamoyl-(O-karboxymethyl)-polysucrose

Číslo CAS; není k dispozici

Struktura: FITC-(O-karboxymethyl)-polysucrose (FITC-(O-karboxymethyl)-polysucrose):

Struktura FITC-CM-polysukrózy

Spektrální data

Excitace se nejlépe provádí při 495 nm a fluorescence se měří při 517 nm (obrázek 8). Měření v biologických médiích může významně ovlivnit intenzitu fluorescence, která může být zvýšená nebo snížená. ZKONTROLUJTE

Obrázek 8. Fluorescenční skenování FITC-CM-polysukrózy 70 v 0,025M boritanu pH 9,0 ( 11 mg v 50 ml pufru). Excitace 495 nm; emise 517 nm.

Skladování a stabilita

FITC-CM-polysukróza se dodává jako suchý žlutý prášek a měl by se skladovat v dobře uzavřených nádobách při pokojové teplotě ve tmě. Roztoky lze uchovávat při pokojové teplotě nebo nejlépe v chladničce ve tmě při pH 6-7 po dobu několika týdnů.

Použití

FITC-CM-polysukróza sehrála zajímavou roli při objasňování vlastností glomerulární membrány a ukazuje se, že navzdory negativnímu charakteru membrány je permselektivita aniontových derivátů Ficollu větší než neutrálních druhů²⁸. Pozdější studie s použitím FITC-CM-polysukrózy však tato zjištění vyvrátily³⁹. Významná role náboje rozpuštěné látky v sítovém charakteru glomerulární membrány byla znovu zkoumána⁴⁰.

 

<.a name="12" id="12">FITC-Inulin

Chemické názvy:

Inulin(3',6'dihydroxy-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen]-5(nebo 6)-yl)karbamothioát
Fluorescein isothiokyanát-inulin

Číslo CAS;  není k dispozici

Struktura:

Vlastnosti

Frakce inulinu získaná z hlíz jiřinek je značena fluoresceinem postupem podobným tomu, který popsali de Belder a Granath¹. Fluoresceinová část je připojena stabilní thiokarbamoylovou vazbou a postup značení nevede k žádné depolymeraci inulinu. DS FITC-inulinu se pohybuje v rozmezí 0,001-0,008 a při těchto nízkých hladinách substituce je vliv nábojů minimální.

FITC-inulin se dodává jako žlutý prášek, který se rozpouští ve vodě nebo roztoku soli za vzniku žlutého roztoku. Zředěné roztoky (1 - 2 %)  zůstávají při stání čiré, ale koncentrovanější ( 10 %) mohou při stání tvořit sraženiny, protože inulin má tendenci vytvářet krystalické agregáty. Tyto sraženiny se při zahřátí znovu rozpustí. Teploty do 80 °C mohou být použity za předpokladu, že roztok má přibližně neutrální pH. Produkt se také rozpouští v DMSO, formamidu a některých dalších polárních organických rozpouštědlech, ale je nerozpustný v nižších alifatických alkoholech, acetonu, chloroformu, dimethylformamidu a ethylacetátu.

Mw FITC-inulinu stanovená metodou SEC (Superose 6 + 12; kalibrace dextranem) je přibližně 5 000 Mw. Phelps⁴⁰ stanovil Mw inulinových frakcí z údajů o osmotickém tlaku a získal hodnotu 5640.

Spektrální údaje

Excitace se nejlépe provádí při 490 nm a fluorescence se měří při 520 nm (obrázek 9). Měření v biologických médiích může výrazně ovlivnit intenzitu fluorescence, která může být zvýšena nebo snížena. Závislost fluorescence na pH je znázorněna na obrázku 10.

Obrázek 9. Fluorescenční skenování FITC-inulinu v 0,025M boritanu pH 9,0 (10 mg v 50 ml pufru). Excitace 492 nm; emise 519 nm.

Skladování a stabilita

Stabilita thiokarbamoylové vazby mezi fluoresceinovou částí a inulinem bude podobná jako u dextranu (informace o stabilitě FITC-dextranu viz datový soubor). Neexistují žádné prospektivní studie stability FITC-inulinu, ale retrospektivní studie ukázaly, že prášek FITC-inulinu je při skladování ve vzduchotěsných obalech při pokojové teplotě stabilní po dobu nejméně 6 let. Roztoky FITC-inulinu by neměly být skladovány při pH(< 5) nebo vysokém pH(> 9) po delší dobu, zejména při zvýšených teplotách.

Použití

Ukázalo se, že FITC-inulin je ideální pro studium rychlosti glomerulární filtrace u pokusných zvířat, protože je stabilní během filtrace a průchodu ledvinami a neváže se na plazmatické bílkoviny ani neproniká do ledvinových buněk. Měření fluorescence poskytuje kvantitativní údaje o transportu a propustnosti zdravých a nemocných tkání. Tyto studie lze provádět v reálném čase pomocí intravitální fluorescenční mikroskopie. Tato technika nabízí vysokou citlivost a ve tkáňových tekutinách lze detekovat koncentrace až do 1 µg/ml.

Poměr koncentrace v tubulární tekutině a plazmě byl stanoven u potkanů po bolusové injekci FITC-inulinu do femorální žíly⁴¹. Platnost metody jako míry glomerulární filtrace byla stanovena srovnáním s 51Cr-EDTA a [H3]-inulinem.

Důkladné zkoumání použití FITC-inulinu pro studie GFR prezentoval Fleck v roce 1999⁴². Potkanům byly podávány 4 mg/ml rychlostí 4 ml/100 g tělesné hmotnosti za hodinu přes ocasní žílu nebo krční žílu. Dunn a spolupracovníci⁴³ zjistili vynikající korelaci mezi clearance kreatininu a clearance FITC-inulinu u myší. Byly popsány i další studie využívající FITC-inulin ke stanovení glomerulární filtrace^44,45.

FITC-inulin byl použit ke studiu propustnosti  střevních epiteliálních buněk^46,47.

 

Fluorescein Hyaluronic Acid (FHA-Se)

Chemical Names:

5-aminofluoresceinem značený hyaluronan
5-aminofluoresceinem značený hyaluronan

Číslo CAS; není k dispozici

Struktura:

Vlastnosti

Kyselina hyaluronová, polysacharid složený ze střídajících se β(1-3) glukuronidů a β(1-4) glukosaminidových jednotek -získaných ze Streptococcus equi, se značí 5-amino-fluoresceinem za vzniku žlutého vláknitého produktu, který je rozpustný ve vodě a elektrolytech, avšak pevná látka vyžaduje dlouhodobé jemné míchání - přes noc - aby se rozpustila⁴⁸. Stupeň substituce se pohybuje mezi 0,001 a 0,008. Molekulová hmotnost stanovená pomocí systému GPC, kalibrovaného pomocí standardů dextranu, poskytla Mw 6,0 x 10⁶

Spektrální údaje

Obrázek 11. Fluorescenční skenování kyseliny FITC-hyaluronové v 0,025M boritanu pH 9,0 (12 mg v 50 ml pufru). Excitace 495 nm; emise 524 nm.

Skladování a stabilita

Sušený přípravek by měl být skladován ve vzduchotěsných obalech při pokojové teplotě ve tmě. Navrhuje se doba použitelnosti 5 let. Při inkubaci roztoku přípravku při pH 7,5 a teplotě 37 °C po dobu jednoho měsíce nebylo zaznamenáno žádné uvolňování fluorescenčního materiálu⁴⁸.

Použití

V posledních letech se objevilo mnoho aplikací hyaluronanu jak v medicíně(zejména jeho nezastupitelný přínos v oční chirurgii), tak v kosmetice. Kyselinu hyaluronovou značenou fluoresceinem lze použít jako sondu pro sledování osudu hyaluronanu in vitro. Přípravek hyaluronové kyseliny značený FITC výrazně zlepšil vizualizaci prostupu substrátu kůží⁴⁹. Objevily se další aplikace kyseliny hyaluronové značené fluoresceinem^50-53

 

Polysacharidy značené TRITC

TRITC-Dextran

Chemické názvy:

Tetramethyl-rhodamin isothiokyanát-dextran
Dextran 3´, 6´bis(tetramethylamino)-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H),9´-9H]xanthen]-5(nebo 6)-yl)karbamothioát.
Tetramethyl-rhodamin B thiokarbamoyl-dextran

Číslo CAS; není k dispozici

Struktura:

Vlastnosti

TRITC-dextrany se připravují z vybraných frakcí dextranů spojením s izothiokyanátem tetrametylrhodaminu B (smíšené izomery). DS( TRITC) se pohybuje od 0,001 do 0,008. Při těchto nízkých stupních substituce je příspěvek náboje terciárních aminoskupin na rhodaminové části zanedbatelný. U všech šarží se kontroluje molekulová hmotnost, ztráta sušením a volný TRITC.

Spektrální údaje

Excitace se nejlépe provádí při 550 nm a fluorescence se měří při 572 nm (obrázek 12). Studie v našich laboratořích ukázaly, že fluorescence z roztoku TRITC-dextranu vykazuje pouze malé změny v rozmezí pH 3-9 (obrázek 13). To je zajímavé při provádění kvantitativních měření. Měření v biologických médiích může výrazně ovlivnit intenzitu fluorescence, která může být zvýšena nebo snížena.

Obrázek 12. Fluorescenční sken TRITC-dextranu 40 v 0,025M boritanu pH 9,0 (10 mg v 50 ml pufru) Excitace 550 nm; Emise 572 nm.

Obrázek 13. Závislost intenzity fluorescence (em. 572 nm) TRITC-dextranu na pH.

Skladovatelnost a stabilita

Stabilita TRITC-dextranů nebyla podrobně zkoumána, ale předpokládá se, že je podobná stabilitě FITC-dextranů, protože v obou případech jsou substituenty vázány přes thiokarbamoylovou jednotku. Pouze při zvýšeném pH (>9) a zvýšené teplotě existuje riziko hydrolýzy thiokarbamoylové vazby (viz FITC-dextran). Roztoky TRITC-dextranu (pH 6-7) lze skladovat při pokojové teplotě ve tmě po dobu několika týdnů. Suchý prášek při skladování v dobře uzavřených nádobách ve tmě má trvanlivost 5 let.

Použití

TRITC-dextrany se používají především ke studiu propustnosti a transportu v buňkách, cévách a tkáních. Měření fluorescence lze provádět kvantitativně a v reálném čase pomocí intravitální fluorescenční mikroskopie. Tato technika nabízí vysokou citlivost a ve tkáňových tekutinách lze detekovat koncentrace až do 1 μg/ml. Další důležitou vlastností je, že TRITC-dextran se neváže na stěny tepen^54,55.

Mikrovaskulatura křeččího lícního vaku se ukázala jako užitečný model pro studium úniku plazmy v důsledku různých zánětlivých stavů. Lícní váčky se zkoumají intravitální fluorescenční mikroskopií s použitím vhodného filtru (490/520 nm) a snímky se pořizují digitální kamerou (obrázek 14). Podává se i.v. 5% roztok TRITC-dextranu 150 ve fyziologickém roztoku (přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti)^56-58. Více informací o těchto technikách naleznete v článku Thorball³. TRITC-dextrany byly hojně používány pro studie propustnosti ve tkáních a buňkách a uvádíme pouze několik namátkou vybraných odkazů^59-65.

Obrázek 14. TRITC-dextran 150 vstříknutý do lícní kosti křečka 15 minut po podání histaminu. (s laskavým svolením E.Svensjö).

TRITC-Polysucrose (TRITC-Ficoll^®)

Chemické názvy:

Tetramethyl-rhodamin isothiokyanát-polysukróza
Polysukróza 3´,6´bis(tetramethylamino)-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H),9´-9H]xanthen]-5(nebo 6)-yl)karbamothioát.
Tetramethyl-rhodamin B thiokarbamoyl-polysukróza

Číslo CAS; není k dispozici

Struktura:

Vlastnosti

TRITC-polysukróza je derivát polysukrózy - polymeru syntetizovaného zesíťováním sacharózy epichlorhydrinem. TRITC-polysukróza se připravuje reakcí polysukrózy s TRITC za podobných podmínek, jaké se používají pro TRITC-dextrany. TRITC-polysukróza je snadno rozpustná ve vodě a v roztocích solí v širokém rozmezí pH. Polysukróza je citlivější na kyseliny než dextran, takže při práci s kyselým pH je třeba dbát zvýšené opatrnosti. Dodává se jako červený prášek, který je volně rozpustný ve vodě.

Spektrální údaje

Obrázek 15. Fluorescenční sken TRITC-polysukrózy 70 v 0,025M boritanu pH 9,0 (11 mg v 50 ml pufru) Excitace 522 nm; Emise 552 nm.

Skladování a stabilita

TRITC-polysacharidový prášek je při skladování ve vzduchotěsných obalech při pokojové teplotě stabilní po dobu nejméně 6 let. Stabilita TRITC-polysukrosy v roztoku nebyla podrobně zkoumána. Stabilita thiokarbamoylové vazby mezi tetramethylrhodaminovou částí a polysukrosou bude podobná jako u dextranu (TRITC-dextran). Skladování při nízkém pH se však pro výrobky na bázi polysukrosy nedoporučuje vzhledem k labilitě glykosidických vazeb v sacharóze. Samotnou polysukrózu lze autoklávovat při neutrálním a mírně alkalickém pH.

Použití

Polysukróza s obsahem TRITC má podobné použití, jaké bylo popsáno u polysukrózy s obsahem FITC, má však určité výhody. Jak již bylo zmíněno, fluorescence tetramethylrhodaminu je méně závislá na pH než u značek FITC. Také delší vlnová délka emise zabraňuje interferenci pozadí v experimentálním prostředí.

TRITC-polysukróza 70 byla použita při studiu endoteliální bariéry ledvin^66,67. Studie protilátkové odpovědi na antigeny nezávislé na thymu byly prováděny pomocí TRITC-fikolů⁶⁸.

 

Kyselina tetrametyl-rhodaminová hyaluronová (TR-HA)

Chemické názvy:

Kyselina tetramethyl-rhodaminová hyaluronová
Hyaluronan, 6´bis(tetramethylamino)-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H),9´-9H]xanthen]-5(nebo 6)-yl).
Hyaluronan s tetramethyl-rhodaminem B

Číslo CAS; není k dispozici

Struktura:

.

Vlastnosti

Kyselina hyaluronová, polysacharid složený ze střídajících se β(1-3) glukuronidových a β(1-4) glukosaminidových jednotek, pocházející ze Streptococcus equi, je značena aminotetrametylrhodaminem, čímž vzniká červený produkt rozpustný ve vodě a elektrolytech. DS se pohybuje mezi 0,001 a 0,008. Mw stanovená pomocí systému GPC, kalibrovaného pomocí standardů dextranu, poskytla hodnotu 6,0 x 10⁶.

Spektrální údaje

Obrázek 16. Fluorescenční sken TR-HA v 0,025M boritanu pH 9,0 (12 mg v 50 ml pufru) Excitace 552 nm; Emise 576 nm.

Použití

Kyselina tetrametyl-rhodaminová hyaluronová (TR-HA) má podobné použití jako kyselina fluoresceinová hyaluronová (viz předchozí část), ale má určité výhody. Jak již bylo zmíněno, fluorescence tetramethylrhodaminu je méně závislá na pH než u značek FITC. Také delší emisní vlnová délka zabraňuje interferenci obrazů pozadí v experimentálním prostředí. Byl popsán invazivní růst do mozkové tkáně s využitím TR-HA a dvoufotonového zobrazování⁶⁹.

1. de Belder A, Granath K. 1973. Preparation and properties of fluorescein-labelled dextrans. Carbohydrate Research. 30(2):375-378. https://doi.org/10.1016/s0008-6215(00)81824-8

2. Kurtzhals P, Larsen C, Johansen M. 1989. High-performance size-exclusion chromatographic procedure for the determination of fluoresceinyl isothiocyanate dextrans of various molecular masses in biological media. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 491117-127. https://doi.org/10.1016/s0378-4347(00)82825-x

3. Thorball N. 1981. FITC-Dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71(2):209-233. https://doi.org/10.1007/bf00507826

4. Svensjo E. 1990. The hamster cheek pouch as a model in microcirculation research. Eur Respir J Suppl.595-601.

5. Jonsson J, Arfors K, Hint H. 1970. Studies on relationships between blood and lymphatic systems within the microcirculation. 6th Europ Conf Microcirculation; Aalborg p. 214-218.

6. Geisow MJ, D'Arcy Hart P, Young MR. 1981. Temporal changes of lysosome and phagosome pH during phagolysosome formation in macrophages: studies by fluorescence spectroscopy.. 89(3):645-652. https://doi.org/10.1083/jcb.89.3.645

7. Ohkuma S, Poole B. 1978. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75(7):3327-3331. https://doi.org/10.1073/pnas.75.7.3327

8. MOCHIZUKI T, SATSU H, TOTSUKA M, SHIMIZU M. 2009. Transepithelial Transport of Macromolecular Substances in IL-4 Treated Human Intestinal T84 Cell Monolayers. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73(11):2422-2426. https://doi.org/10.1271/bbb.90383

9. Lei B, Zha W, Wang Y, Wen C, Studer EJ, Wang X, Jin F, Wang G, Zhang L, Zhou H. 2010. Development of a Novel Self-Microemulsifying Drug Delivery System for Reducing HIV Protease Inhibitor-Induced Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction. Mol. Pharmaceutics. 7(3):844-853. https://doi.org/10.1021/mp100003r

10. BERTHIAUME F, EZZELL RM, TONER M, YARMUSH ML, TOMPKINS RG. 1994. Transport of fluorescent dextrans across the rat ileum after cutaneous thermal injury. Critical Care Medicine. 22(3):455-464. https://doi.org/10.1097/00003246-199403000-00016

11. Hultström D. 1982. FITC-dextrans in neurobiological research. Acta Universitatis Upsaliensis.438.

12. Olsson Y, Svensj? E, Arfors K-, Hultstr?m D. 1975. Fluorescein labelled dextrans as tracers for vascular permeability studies in the nervous system. Acta Neuropathol. 33(1):45-50. https://doi.org/10.1007/bf00685963

13. Wang S, Baseri B, Choi JJ, Tung Y, Morrison B, Konofagou EE. 2008. Delivery of fluorescent dextrans through the ultrasound-induced blood-brain barrier opening in mice. https://doi.org/10.1109/ultsym.2008.0416

14. Gerlowski LE, Jain RK. 1986. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvascular Research. 31(3):288-305. https://doi.org/10.1016/0026-2862(86)90018-x

15. Li T, Hao Q, Wang X, Liu Q. 2009. The effect of focused ultrasound on the physicochemical properties of Sarcoma 180 cell membrane. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 26(5):941-6.

16. Chen F, Hou M, Ye F, Lv W, Xie X. 2009. Ovarian Cancer Cells Induce Peripheral Mature Dendritic Cells to Differentiate Into Macrophagelike Cells In Vitro. Int J Gynecol Cancer. 19(9):1487-1493. https://doi.org/10.1111/igc.0b013e3181bb70c6

17. Mannermaa E, Reinisalo M, Ranta V, Vellonen K, Kokki H, Saarikko A, Kaarniranta K, Urtti A. 2010. Filter-cultured ARPE-19 cells as outer blood?retinal barrier model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 40(4):289-296. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2010.04.001

18. Shivanna M, Rajashekhar G, Srinivas SP. 2010. Barrier Dysfunction of the Corneal Endothelium in Response to TNF-?: Role of p38 MAP Kinase. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.. 51(3):1575. https://doi.org/10.1167/iovs.09-4343

19. Lightman SL, Caspers-Velu LE, Hirose S, Nussenblatt RB, Palestine AG. 1987. Angiography With Fluorescein-Labeled Dextrans in a Primate Model of Uveitis. Archives of Ophthalmology. 105(6):844-848. https://doi.org/10.1001/archopht.1987.01060060130048

20. Lencer WI, Weyer P, Verkman AS, Ausiello DA, Brown D. 1990. FITC-dextran as a probe for endosome function and localization in kidney. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 258(2):C309-C317. https://doi.org/10.1152/ajpcell.1990.258.2.c309

21. Stewart SE, Kondos SC, Matthews AY, D'Angelo ME, Dunstone MA, Whisstock JC, Trapani JA, Bird PI. 2014. The Perforin Pore Facilitates the Delivery of Cationic Cargos. J. Biol. Chem.. 289(13):9172-9181. https://doi.org/10.1074/jbc.m113.544890

22. Uchida N, Maitani Y, Machida Y, Nakagaki M, Nagai T. 1991. Influence of bile salts on the permeability of insulin through the nasal mucosa of rabbits in comparison with dextran derivatives. International Journal of Pharmaceutics. 74(2-3):95-103. https://doi.org/10.1016/0378-5173(91)90226-e

23. GEKKO K. 1981. Solution Properties of Dextran and Its Ionic Derivatives.415-438. https://doi.org/10.1021/bk-1981-0150.ch029

24. Gekko K, Noguchi H. 1979. Selective interaction of calcium and magnesium ions with ionic dextran derivatives. Carbohydrate Research. 69(1):323-326. https://doi.org/10.1016/s0008-6215(00)85786-9

25. Smidsrød O, Haug A. 1971. Estimation of the relative stiffness of the molecular chain in polyelectrolytes from measurements of viscosity at different ionic strengths. Biopolymers. 10(7):1213-1227. https://doi.org/10.1002/bip.360100711

26. Rongved P, Klaveness J. 1991. Water-soluble polysaccharides as carriers of paramagnetic contrast agents for magnetic resonance imaging: Synthesis and relaxation properties. Carbohydrate Research. 214(2):315-323. https://doi.org/10.1016/0008-6215(91)80038-o

27. Zheng S, Huang M, Hong R, Deng S, Cheng L, Gao B, Badami D. 2014. RGD-conjugated iron oxide magnetic nanoparticles for magnetic resonance imaging contrast enhancement and hyperthermia. J Biomater Appl. 28(7):1051-1059. https://doi.org/10.1177/0885328213493486

28. Asgeirsson D, Venturoli D, Rippe B, Rippe C. 2006. Increased glomerular permeability to negatively charged Ficoll relative to neutral Ficoll in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 291(5):F1083-F1089. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00488.2005

29. Martin C, Dolmazon E, Moylan K, Fowley C, McHale AP, Callan JF, Callan B. 2015. A charge neutral, size tuneable polymersome capable of high biological encapsulation efficiency and cell permeation. International Journal of Pharmaceutics. 481(1-2):1-8. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2014.12.061

30. Venturoli D, Rippe B. 2005. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288(4):F605-F613. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00171.2004

31. Rosengren B, Rippe A, Rippe C, Venturoli D, Swärd K, Rippe B. 2006. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291(3):H1371-H1377. https://doi.org/10.1152/ajpheart.01364.2005

32. Rippe C, Asgeirsson D, Venturoli D, Rippe A, Rippe B. 2006. Effects of glomerular filtration rate on Ficoll sieving coefficients (?) in rats. Kidney International. 69(8):1326-1332. https://doi.org/10.1038/sj.ki.5000027

33. Oliver III JD, Anderson S, Troy JL, Brenner BM, Deen WH. 1992. Determination of glomerular size-selectivity in the normal rat with Ficoll. J Am Soc Nephrol. 3(2):214-28.

34. Axelsson J, Mahmutovic I, Rippe A, Rippe B. 2009. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297(3):F577-F582. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00246.2009

35. Grände G, Rippe C, Rippe A, Rahman A, Swärd K, Rippe B. 2009. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297(2):F257-F262. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00075.2009

36. Ohlson M, Sörensson J, Haraldsson B. 2000. Glomerular size and charge selectivity in the rat as revealed by FITC-Ficoll and albumin. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 279(1):F84-F91. https://doi.org/10.1152/ajprenal.2000.279.1.f84

37. Rippe C, Rippe A, Torffvit O, Rippe B. 2007. Size and charge selectivity of the glomerular filter in early experimental diabetes in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293(5):F1533-F1538. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00271.2007

38. Axelsson J, Sverrisson K, Rippe A, Fissell W, Rippe B. 2011. Reduced diffusion of charge-modified, conformationally intact anionic Ficoll relative to neutral Ficoll across the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 301(4):F708-F712. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00183.2011

39. Ferrell N, Groszek J, Li L, Smith R, Butler RS, Zorman CA, Roy S, Fissell WH. 2011. Basal lamina secreted by MDCK cells has size- and charge-selective properties. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300(1):F86-F90. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00484.2010

40. PHELPS C. 1965. THE PHYSICAL PROPERTIES OF INULIN SOLUTIONS. 95(1):41-47. https://doi.org/10.1042/bj0950041

41. SOHTELL M, KARLMARK B, ULFENDAHL H. 1983. FITC-inulin as a kidney tubule marker in the rat. 119(3):313-316. https://doi.org/10.1111/j.1748-1716.1983.tb07345.x

42. Fleck C. 1999. Determination of the glomerular filtration rate (GFR): methodological problems, age-dependence, consequences of various surgical interventions, and the influence of different drugs and toxic substances. Physiol Res. 48(4):267-79.

43. Dunn SR, Qi Z, Bottinger EP, Breyer MD, Sharma K. 2004. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney International. 65(5):1959-1967. https://doi.org/10.1111/j.1523-1755.2004.00600.x

44. Qi Z, Whitt I, Mehta A, Jin J, Zhao M, Harris RC, Fogo AB, Breyer MD. 2004. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 286(3):F590-F596. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00324.2003

45. Lorenz JN, Gruenstein E. 1999. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 276(1):F172-F177. https://doi.org/10.1152/ajprenal.1999.276.1.f172

46. Baker N, Graham L. 2010. Campylobacter fetus translocation across Caco-2 cell monolayers. Microbial Pathogenesis. 49(5):260-272. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2010.06.008

47. Neunlist M, Toumi F, Oreschkova T, Denis M, Leborgne J, Laboisse CL, Galmiche J, Jarry A. 2003. Human ENS regulates the intestinal epithelial barrier permeability and a tight junction-associated protein ZO-1 via VIPergic pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 285(5):G1028-G1036. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00066.2003

48. de Belder AN, Wik K. 1975. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydrate Research. 44(2):251-257. https://doi.org/10.1016/s0008-6215(00)84168-3

49. Yang J, Kim E, Kwon JH, Kim H, Shin JH, Yun SH, Choi KY, Hahn SK. 2012. Transdermal delivery of hyaluronic acid ? Human growth hormone conjugate. Biomaterials. 33(25):5947-5954. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.05.003

50. Yokoo M, Miyahayashi Y, Naganuma T, Kimura N, Sasada H, Sato E. 2002. Identification of Hyaluronic Acid-Binding Proteins and Their Expressions in Porcine Cumulus-Oocyte Complexes During In Vitro Maturation1. 67(4):1165-1171. https://doi.org/10.1095/biolreprod67.4.1165

51. Cheng D, Han W, Yang K, Song Y, Jiang M, Song E. 2014. One-step facile synthesis of hyaluronic acid functionalized fluorescent gold nanoprobes sensitive to hyaluronidase in urine specimen from bladder cancer patients. Talanta. 130408-414. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2014.07.005

52. Yoneda M, Shimizu S, Nishi Y, Yamagata M, Suzuki S, Kimata K. 1988. Hyaluronic acid-dependent change in the extracellular matrix of mouse dermal fibroblasts that is conducive to cell proliferation. J. Cell Sci.. 90275-86.

53. Walsh BA, Mullick AE, Banka CE, Rutledge JC. 2000. 17b-Estradiol acts separately on the LDL particle and artery wall to reduce LDL accumulation. J. Lipid Res.. 41(134-41):

54. Gardner G, Banka CL, Roberts KA, Mullick AE, Rutledge JC. 1999. Modified LDL?Mediated Increases in Endothelial Layer Permeability Are Attenuated With 17?-Estradiol. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19(4):854-861. https://doi.org/10.1161/01.atv.19.4.854

55. Svensjö E, Saraiva EM, Bozza MT, Oliveira SM, Lerner EA, Scharfstein J. 2009. Salivary Gland Homogenates of Lutzomyia longipalpis and Its Vasodilatory Peptide Maxadilan Cause Plasma Leakage via PAC1 Receptor Activation. J Vasc Res. 46(5):435-446. https://doi.org/10.1159/000197866

56. Mullick AE, Walsh BA, Reiser KM, Rutledge JC. 2001. Chronic estradiol treatment attenuates stiffening, glycoxidation, and permeability in rat carotid arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281(5):H2204-H2210. https://doi.org/10.1152/ajpheart.2001.281.5.h2204

57. Geisow MJ. 1984. Fluorescein conjugates as indicators of subcellular pH. Experimental Cell Research. 150(1):29-35. https://doi.org/10.1016/0014-4827(84)90698-0

58. Ohkuma S, Poole B. 1978. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75(7):3327-3331. https://doi.org/10.1073/pnas.75.7.3327

59. van der Wijk T, Tomassen SFB, Houtsmuller AB, de Jonge HR, Tilly BC. 2003. Increased Vesicle Recycling in Response to Osmotic Cell Swelling. J. Biol. Chem.. 278(41):40020-40025. https://doi.org/10.1074/jbc.m307603200

60. Kauppi M, Simonsen A, Bremnes B, Vieira A, Callaghan J, Stenmark H, Olkkonen VM. 2002. The small GTPase Rab22 interacts with EEA1 and controls endosomal membrane trafficking. J. Cell Sci..(115):899-911.

61. Mairhofer M, Steiner M, Salzer U, Prohaska R. 2009. Stomatin-like Protein-1 Interacts with Stomatin and Is Targeted to Late Endosomes. J. Biol. Chem.. 284(42):29218-29229. https://doi.org/10.1074/jbc.m109.014993

62. Hutchens MP, Fujiyoshi T, Komers R, Herson PS, Anderson S. 2012. Estrogen protects renal endothelial barrier function from ischemia-reperfusion in vitro and in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303(3):F377-F385. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00354.2011

63. Amlot PL, Grennan D, Humphrey JH. 1985. Splenic dependence of the antibody response to thymus-independent (TI-2) antigens. Eur. J. Immunol.. 15(5):508-512. https://doi.org/10.1002/eji.1830150516

64. Pusch A, Boeckenhoff A, Glaser T, Kaminski T, Kirfel G, Hans M, Steinfarz B, Swandulla D, Kubitscheck U, Gieselmann V, et al. 2010. CD44 and hyaluronan promote invasive growth of B35 neuroblastoma cells into the brain. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1803(2):261-274. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2009.12.003