Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)

Reagencie a vybavení

1. 20x Fyziologicko-sodný citrátový pufr (SSC: 3 M NaCl, 0.3 M citrát sodný, pH 7, nebo výrobek č.  S6639)
2. RNáza A (výrobek č.  R4642). 100 µg/ml v 2x SSC
3. Pepsin (Číslo výrobku  P6887) 40 units/mL in 10 mM HCl
4. Paraformaldehyde, EM grade (Product No. P6148) čerstvě depolymerizovaný, 4% w/v ve vodě
5. Ethanol
6. Značená sonda. Plazmidová DNA se značí biotinem-11-dUTP pomocí náhodného primingu s niklovým překladem nebo A3803 (např.g., ADVANCE™ Nick Translation Kit)
7. Roztok hybridizační směsi: 50% formamide (Product No. F7508), 10% dextran sulfate (Product No. D8906), 0.1% SDS (Product No. L4390), 0,5-1,5 ng/µl značené sondy a 300 ng/µl DNA lososích spermií (produkt č.  L4390). D7656) v 2x SSC
8. Proplachovací pufr: 20% formamid (č. výrobku  F7508) v 0,1x SSC
9. Detekční pufr: 20% formamid (č. výrobku  F7508) v 0,1x SSC: 0,2 % Tween 20 (č. produktu  P1379) v 4x SSC
10. Blokující pufr: 5 % hovězího albuminu (č. výrobku  A3803) v detekčním pufru
11. Protilátky nebo detekční sloučenina (např, Streptavidin-Cy3, č. výrobku  S6402) v blokovacím pufru
12. DAPI (č. výrobku  D9542). 2 µg/ml v montážním médiu proti vyblednutí.
13. Fluorescenční mikroskop, filtry a volitelný trojitý pásmový filtr (x58, Omega Optics)
14. Skleněná sklíčka (produkt č.  . S8400)
15. Plastové krycí sklíčka pro inkubační a hybridizační kroky (vystřižená z autoklávovatelných sáčků na odpad, např, Product No. B4408)
16. Heat block/ modified thermocycler
17. Coplin jars for washing steps (Product No. S6016, S5641 nebo S5891)

Procedura

Příprava snímku
Hybridizace
Detekce

Příprava slidu

1. Začněte s přípravou chromozomů z libovolného typu buněk.
2. Inkubujte s 200 µl RNázy po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C
3. Sklíčka omyjte v 2x SSC po dobu 5 minut. Opakujte.
4. Opláchněte sklíčka v 10 mM HCl.
5. Inkubujte s 200 µl pepsinu po dobu 10 minut při 37 °C.
6. Opláchněte sklíčka v deionizované H₂O.
7. Omyjte sklíčka v 2x SSC po dobu 5 minut. Opakujte.
8. Stabilizujte sklíčka v paraformaldehydu po dobu 10 minut.
9. Omyjte sklíčka v 2x SSC po dobu 5 minut. Opakujte.
10. Dehydratujte sklíčka v sérii ethanolu: 70 %, 80 %, 95 %; vždy 2 minuty.
11. Sušte na vzduchu.

Hybridizace

1. Připravte 30 µl hybridizačního roztoku na jedno sklíčko. Zahřejte na 70 °C. po dobu 10 minut a umístěte na led.
2. Na každé sklíčko naneste 30 µl hybridizačního roztoku a přikryjte plastovým krycím sklíčkem.
3. Sklíčko nechte 5 minut na tepelném bloku kondenzovat při teplotě 65-70 °C.
4. Postupně snižujte teplotu na 37 °C.
5. Hybridizujte při 37 °C přes noc ve vlhké komoře.

Detekce

1. Sklíčka omyjte v 2x SSC a odstraňte krycí sklíčko.
2. Sklíčka omyjte v promývacím pufru při teplotě 40 °C po dobu 5 minut. Opakujte.
3. Sklíčka vymyjte v 0,1x SSC při 40 °C po dobu 5-15 minut.
4. Sklíčka vymyjte v 2x SSC při 40 °C po dobu 5-15 minut.
5. Sklíčka ochlaďte na pokojovou teplotu.
6. Klimatizujte sklíčka v detekčním pufru po dobu 5 minut.
7. Blokujte v blokovacím pufru po dobu 20-30 minut.
8. Inkubujte s 50 µl protilátky nebo detekční směsi po dobu 30-60 minut (např, 5 µg/ml Streptavidin-Cy3 v blokovacím pufru).
9. Proplachujte sklíčka v 2x SSC po dobu 5 minut. Opakujte dvakrát.
10. Kontrabarvení roztokem DAPI po dobu 10 minut.
11. Krátce opláchněte a namontujte do montážního média proti vyblednutí.
12. Analyzujte pomocí fluorescenčního mikroskopu.
    

Odkazy

1. Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.

2. Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.

3. Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.