Měření doby života fluorescence

Úvod

Doba života fluorescence (FLT) je doba, kterou fluorofor stráví v excitovaném stavu, než vyzáří foton a vrátí se do základního stavu. FLT se může v závislosti na fluoroforu pohybovat od pikosekund až po stovky nanosekund.

Doba života populace fluoroforů je doba, za kterou se změří počet excitovaných molekul, aby se exponenciálně rozpadl na N/e (36.8 %) původní populace ztrátou energie fluorescenčními nebo nezářivými procesy.

Doba života fluorescence je vnitřní vlastností fluoroforu. FLT nezávisí na koncentraci fluoroforu absorpci vzorkem, tloušťce vzorku, metodě měření, intenzitě fluorescence, fotobělení a/nebo intenzitě excitace. Je ovlivněna vnějšími faktory, jako je teplota, polarita a přítomnost zhášečů fluorescence. Doba života fluorescence je citlivá na vnitřní faktory, které závisí na struktuře fluoroforu.¹

Metody stanovení doby života fluorescence fluoroforů

Dobu života fluorescence lze měřit buď ve frekvenční, nebo v časové oblasti.

Metoda v časové oblasti zahrnuje osvětlení vzorku (kyvety, buněk nebo tkáně) krátkým světelným pulsem a následné měření intenzity emise v závislosti na čase. FLT se určí ze sklonu křivky rozpadu. Pro měření doby života je k dispozici několik metod detekce fluorescence, z nichž časově korelované počítání jednotlivých fotonů (TCSPC) umožňuje jednoduchý sběr dat a rozšířené kvantitativní počítání fotonů.

Metoda frekvenční oblasti zahrnuje sinusovou modulaci dopadajícího světla při vysokých frekvencích. Při této metodě dochází k emisi na stejné frekvenci jako dopadající světlo doprovázené fázovým zpožděním a změnou amplitudy vzhledem k excitačnímu světlu (demodulace).

Výhody měření doby života fluorescence oproti měření založenému na intenzitě²

1. Měření doby života nevyžaduje sondy s vlnovou délkou, které umožňují kvantitativní stanovení mnoha analytů.
2. Metoda doby života rozšiřuje citlivost koncentračního rozsahu analytu použitím sond se spektrálním posunem.
3. Měření doby života lze použít pro analyty, pro které neexistují přímé sondy. Mezi tyto analyty patří glukóza, antigeny nebo jakékoli afinitní či imunoanalýzy založené na mechanismu přenosu fluorescenční energie.

Aplikace

Doba života fluorescence:

Doba života fluorescence je robustní parametr pro použití v několika biologických testech. Má potenciál nahradit konvenční techniky měření, jako je absorpce, luminiscence nebo intenzita fluorescence.³ Jakákoli změna fyzikálně-chemického prostředí fluoroforu vede ke změnám doby života fluorescence. Testy založené na době života lze vyvinout s využitím různých mechanismů, například jednoduchého vazebného testu, který zahrnuje vazbu dvou složek (jedna je fluorescenčně značená), která vyvolá změnu FLT. Dalším mechanismem je zkouška typu quench-release, která zahrnuje zhášený druh přítomný ve velkém přebytku, který má nízkou, ale konečnou fluorescenci. Jakmile se fluorescenční sloučenina uvolní (enzymatickou reakcí nebo vazbou na komplementární DNA), doba života systému se změní. FLT lze kombinovat s testy FRET (Försterův rezonanční přenos energie) pro měření účinnosti přenosu energie.

Fluorescenční snímání doby života:

Tato technika je založena na změnách doby života nebo doby rozpadu sondy. Pomocí fázové modulace lze měřit nanosekundové (ns) doby rozpadu. Tato technika byla hojně využívána pro snímání pH, Ca²⁺, K⁺, glukózy a dalších metabolitů. V poslední době došlo k vývoji v oblasti použití snímání na základě doby života ve tkáních a jiných náhodných médiích pomocí optických sond s excitačním a emisním spektrem v blízké infračervené oblasti.^4,5

Zobrazení doby života fluorescence (FLI):

Tato technika je relativně nová a zahrnuje stanovení prostorového rozložení doby rozpadu fluorescence v každém pixelu obrazu současně. Je založena na skutečnosti, že doba života fluorescence fluoroforu závisí na jeho molekulárním prostředí, ale nikoli na jeho koncentraci. Lze ji použít ve fluorescenční mikroskopii, kde nelze kontrolovat lokální koncentraci sondy. Fluorescenční zobrazovací mikroskopie s dobou života (FLIM) se používá při měření parametrů molekulárního prostředí, interakce proteinů pomocí Försterova rezonančního přenosu energie (FRET), a metabolického stavu buněk a tkání prostřednictvím jejich autofluorescence. Parametry molekulárního prostředí lze měřit na základě změn doby života vyvolaných zhášením fluorescence nebo změn konformace fluoroforů. FLIM lze využít v biologických aplikacích včetně snímání povrchu tkání, mapování typu tkáně, fotodynamické terapie, analýzy DNA čipů, zobrazování kůže atd.⁶

Slabé zářiče mají kratší dobu života fluorescence, zatímco fluorofory s delší dobou života mají nízkou rychlost obratu fotonů. Pro celoživotní zobrazování nejsou příliš užitečné kvůli své omezené citlivosti a nutnosti dlouhé expozice a doby akvizice.

Různé třídy fluorescenčních molekul a sond běžně používaných při celoživotním zobrazování jsou uvedeny níže:

Odkazy

1. Berezin MY, Achilefu S. 2010. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.. 110(5):2641-2684. https://doi.org/10.1021/cr900343z

2. Szmacinski H, Lakowicz JR. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing and imaging. Sensors and Actuators B: Chemical. 29(1-3):16-24. https://doi.org/10.1016/0925-4005(95)01658-9

3. Doering K, Meder G, Hinnenberger M, Woelcke J, Mayr LM, Hassiepen U. 2009. A Fluorescence Lifetime-Based Assay for Protease Inhibitor Profiling on Human Kallikrein 7. J Biomol Screen. 14(1):1-9. https://doi.org/10.1177/1087057108327328

4. Lakowicz JR. 1994. Topics in Fluorescence Spectroscopy. https://doi.org/10.1007/b112911

5. Hutchinson C, Lakowicz J, Sevick-Muraca E. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing in tissues: a computational study. Biophysical Journal. 68(4):1574-1582. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(95)80330-9

6. Clegg RM, Holub O, Gohlke C. 2003. [22] Fluorescence lifetime-resolved imaging: Measuring lifetimes in an image.509-542. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(03)60126-6