Dlouhodobé sledování živých buněk rakoviny a kmenových buněk pomocí biokompatibilní fluorescenční nanočástice založené na nanotechnologii s indukovanou agregací (AIE Dot)

Nick Asbrock¹, Kevin Su¹, Vi Chu¹, Bin Liu²

¹Assay & Platform Development, Bioscience BU, EMD Millipore, 28820 Single Oak Drive, Temecula, CA, USA 92590, ²Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore, Singapore

• Fluorescenční nanočástice pro sledování buněk
• Materiály a metody pro sledování buněk pomocí nanočástic
• Živé zobrazování buněk pomocí nanočástic LuminiCell Tracker™
• Závěr

Fluorescenční nanočástice pro sledování a trasování buněk

Fluorescenční zobrazovací techniky s vysokým prostorovým rozlišením, snadnou dostupností a nízkou buněčnou toxicitou jsou široce využívány pro experimenty se sledováním a trasováním buněk. V této oblasti dominují fluorescenční reportéry využívající zelený/červený fluorescenční protein (GFP/RFP). Trpí však řadou nevýhod, mezi něž patří: různá účinnost transfekce genů, mutace genů a špatná fotostabilita, což vede k problémům při značení a sledování primárních a kmenových buněk. Naštěstí vývoj barviv propustných pro buňky poskytl jednoduchý přístup přímého fluorescenčního značení. Tato fluorescenční činidla jsou snadno internalizována do buněk, nenarušují normální buněčné aktivity a mohou být v buňkách vysoce udržována během proliferace a diferenciace. Tato značkovací činidla mají extrémně vysokou počáteční fluorescenci, ale jsou citlivá na zhášení signálu a fotobělení. Anorganické polovodičové kvantové tečky byly nedávno vyvinuty jako činidla pro značení a sledování buněk. Sledovací činidla na bázi kvantových teček jsou vysoce emisní a fotostabilní, ale vlastní jádra z těžkých kovů by mohla vést k nežádoucí cytotoxicitě a fluorescenční blikání kvantových teček také omezuje jejich použití při ultrarychlém snímání.

V tomto článku upozorňujeme na fluorescenční nanočástice LuminiCell Tracker™ pro lepší dlouhodobou vizualizaci a sledování nádorových a kmenových buněk v in vitro a in vivo prostředí. Na rozdíl od běžných barviv, která trpí koncentrací nebo agregací způsobenou zhášením (ACQ), využívají sledovače LuminiCell výhod nových barviv s Vlastnosti emisí vyvolaných agregací (AIE)^1,2,3,4,5. Tato nová barviva AIE pro sledování buněk byla zapouzdřena do buněk propustných biokompatibilních fluorescenčních nanočástic (AIE Dot); poskytují ultra jasnou fluorescenci (10x), zvýšenou fotostabilitu (3x) a nízkou buněčnou toxicitu po delší dobu pro aplikace v oblasti biozobrazování.

Obrázek 1. Fyzikální vlastnosti fluorescenčních nanočástic LuminiCell Tracker™. A) Výroba nanočástic LuminiCell Tracker™ zahrnuje zapouzdření fluorescenčních molekul TPETPAFN AIE do vnějšího obalu DSPE-PEG200 s připojenými sekvencemi TAT propustnými pro buňky; i) samouspořádání a ii) biokonjugaci. B) Porovnání fyzikální stability mezi LuminiCell Trackers™ a komerčními Qtracker^®, když byly oba inkubovány v 1X PBS při 37 °C po dobu 0 až 9 dnů.

Materiály a metody pro sledování buněk pomocí nanočástic

Konstrukce zařízení LuminiCell Tracker™ 540 a 670

Výroba zařízení LuminiCell Tracker™ 540 nebo 670 vyžaduje tři zásadní kroky: Návrh a syntéza barviv AIE, konstrukce teček AIE a funkcionalizace povrchu. Barvivo AIE tetrafenylethen (TPE) se používá pro ladění struktury a modifikaci, aby barviva AIE měla zelenou a červenou emisi. Naše zavedená strategie výroby organických nanočástic se používá k výrobě nanočástic AIE teček zrozených s povrchovými funkčními skupinami (obrázek 1). Nakonec jsou syntetizované nanočástice AIE Dot s povrchovými funkčními skupinami dále upraveny tak, aby byla zajištěna jejich internalizace a retence v buňkách pomocí sekvencí TAT.

Značení a zobrazování buněk

Buňky v růstovém médiu byly nasazeny na skleněnou komůrku s 8 jamkami pro zobrazování fixovaných i živých buněk. Hustota výsevu byla zvolena tak, aby po noční kultivaci byla zajištěna 60 až 80% konfluence. Druhý den po nasazení buněk bylo růstové médium nahrazeno čerstvým růstovým médiem obsahujícím zředěný přípravek LuminiCell Tracker™ 540 nebo 670 s inkubací 4 nM. Buňky byly poté inkubovány při teplotě 37 ^◦C, 5 % CO₂ inkubátoru po dobu 4 h. Pro různé typy buněk lze použít jinou koncentraci a dobu inkubace. Po 4 h inkubaci bylo médium obsahující LuminiCell Tracker™ odstraněno a buňky byly dvakrát promyty pufrem 1 X PBS a buňky byly připraveny k vizualizaci živých buněk. Pro zobrazování fixovaných buněk byly buňky fixovány po dobu 20 minut při pokojové teplotě 4% formaldehydem v pufru PBS. Po 20minutové fixaci byly buňky dvakrát opláchnuty pufrem PBS a zobrazeny.

Sledování buněk

Buňky byly kultivovány v 6jamkových destičkách v prostředí CO₂ inkubátoru při teplotě 37 ^oC s buněčným kultivačním médiem obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a 1 % penicilinu-streptomycinu (PS). Po celonoční kultivaci bylo buněčné kultivační médium odstraněno a buňky byly dvakrát propláchnuty 1XPBS. Značkovací roztok byl připraven naředěním zásobního roztoku LuminiCell Tracker™ pomocí čerstvého média pro kultivaci buněk s konečnou koncentrací 4 nM. Do každé jamky byly přidány 2 ml značicího roztoku. Po 4 hodinách inkubace byl značkovací roztok odstraněn a buňky byly dvakrát promyty pufrem 1×PBS. Buňky byly odebrány trypsinem. Buněčná suspenze byla dále centrifugována při 1500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut a resuspendována v čerstvém růstovém médiu. Resuspendované buňky byly naředěny a subkultivovány do 6jamkových destiček obsahujících krycí sklíčka pro určené generace. Po určených časových intervalech byly vybrané buňky promyty pufrem PBS a fixovány 75% ethanolem nebo 3,7% formaldehydem v PBS po dobu 20 minut. Krycí sklíčka byla uzavřena montážním médiem a fluorescenční snímky byly studovány fluorescenčním mikroskopem nebo konfokálním laserovým skenovacím mikroskopem.

Sledování in vivo

Pro demonstraci sledování buněk in vivo byly nádorové buňky po inkubaci se 4 nM LuminiCell Tracker™ po dobu 4 hodin odebrány a resuspendovány v růstovém médiu. Buněčná suspenze (1 X 10⁶ v 0,1 ml média) byla injikována do boku myší. Po určeném časovém intervalu po injekci byly myši zobrazeny pomocí zobrazovacího systému IVIS^® Spectrum Imaging.

Zobrazení živých buněk pomocí nanočástic LuminiCell Tracker™

.

Obrázek 2. Zobrazování živých buněk pomocí nanočástic LuminiCell Tracker™. LuminiCell Trackers™ nejsou pro buňky toxické a ve srovnání s tradičními technologiemi na bázi kvantových teček produkují jasnější fluorescenční signály. HeLa buňky byly přes noc rozmístěny v počtu 500 000 buněk na jamku šestijamkové destičky. Druhý den byly přidány 4 nM LuminiCell Tracker™ 670 nebo Qtracker^® 655, které byly inkubovány po dobu 4 hodin a poté zobrazeny v den 1.

Obrázek 3. Experimenty se značením cév. Sada LuminiCell Tracker™-540 pro značení cév umožňuje fluorescenční zobrazování cév in vivo v mozkové a ušní tkáni myší. Sada obsahuje zelené fluorescenční nanočástice AIE Dot bez sekvencí TAT. Tyto nanočástice lze použít k fluorescenčnímu značení cév v živých tkáních a zvířatech pro studie zánětu a cévního úniku.

Obrázek 4. Sledování rakovinných buněk in vitro pomocí zařízení LuminiCell Trackers™. Pro demonstraci schopnosti soupravy pro značení buněk LuminiCell Tracker™-540 byly buňky HeLa inkubovány s přípravkem LuminiCell Tracker™ 540 o koncentraci 4 nM po dobu 4 hodin, poté byl inkubační roztok zlikvidován a buňky byly dále subkultivovány po dobu několika dnů. Přípravek LuminiCell Tracker™ 540 vykázal velmi vysokou účinnost značení, která činila téměř 100 % již 1. den po inkubaci a 5. den po inkubaci se stále pohybovala nad 90 %. Ještě 10. den po inkubaci bylo možné pozorovat rozlišitelnou fluorescenci označených buněk, což svědčí o vynikající schopnosti soupravy LuminiCell Tracker-540™ pro značení buněk sledovat buňky.

Obrázek 5. In Vivo sledování rakovinných buněk pomocí LuminiCell Trackers™ A) In vitro sledování rakovinných buněk MCF-7 pomocí soupravy LuminiCell Tracker™-670 Cell Labeling Kit. B) Reprezentativní in vivo fluorescenční snímek myši subkutánně injikované 1 × 10⁶ buněk MCF-7 bezprostředně po značení pomocí 2 nM LuminiCell Tracker™ 670. C) Graf ukazuje integrovanou intenzitu fluorescence v místech nádoru po celkovou dobu sledování 21 dní.

Monitorování a pochopení osudu podaných kmenových buněk in vivo má velký význam pro terapii kmenovými buňkami. Jako nejslibnější se jeví technika přímého značení buněk, při níž je zařízení LuminiCell Tracker™ s extrémně vysokým jasem, vynikající fotostabilitou a obecnou schopností barvení ideálním řešením pro barvení a vizualizaci aktivit kmenových buněk během terapie kmenovými buňkami. Sledování kmenových buněk bylo provedeno s použitím přístroje LuminiCell Tracker™ 670 jako značkovacího činidla a mezenchymálních kmenových buněk odvozených z tuku (ADSC). Z in vitro experimentu se sledováním vyplynulo, že míra značení po 5 dnech kultivace byla vyšší než 92,5 % (obrázek 6). Po implantaci do myši byl fluorescenční signál rozlišitelný in vivo v místě transplantace ještě po 42 dnech (obrázek 7A). Analýza souběžného barvení jednotlivých buněk navíc ukazuje, že LuminiCell Tracker™ 670 mohl zůstat uvnitř ADSC i po 30 dnech (obrázky 7B, 7C). Tyto údaje podporují užitečnost zařízení LuminiCell Trackers™ pro experimenty s prodlouženým sledováním buněk.

Obrázek 6. In Vitro sledování kmenových buněk pomocí LuminiCell Trackers™ A) Značení pomocí teček AIE umožňuje lepší dlouhodobé sledování tukových mezenchymálních kmenových buněk in vitro (A) ADSC značené pomocí teček AIE, PKH26 i Qtracker^® 655 a následně subkultivované po dobu 1, resp. 5 dnů.

Obrázek 7. In Vivo sledování kmenových buněk pomocí LuminiCell Trackers™ A) In vivo dlouhodobé sledování ADSC. B) Konfokální obraz ischemického plátku zadní končetiny myši po podání matrigela obsahujícího ADSC značené LuminiCell Tracker™ 670 po dobu 30 dnů. C) Reprezentativní snímky CLSM s barvením CD31 ischemických řezů zadní končetiny od myší, kterým byl podáván LuminiCell Tracker™ 670 značený Matrigel obsahující ADSC po dobu 42 dnů, bílé šipky označují překryvnou žlutou nebo oranžovou fluorescenci.

Závěr

Fluorescenční nanočástice LuminiCell Tracker™ představují jednoduché, bezpečné a účinné činidlo pro dlouhodobé sledování buněk. Společnost LuminiCell je založena na nové technologii AIE, která využívá výhod přirozeně nezapravitelného agregátu k zajištění značkovacích činidel s ultra vysokým jasem. LuminiCell Trackers™ vykazují vynikající fluorescenční kvantový výtěžek, vysokou odolnost vůči fotobělení a vynikající biokompatibilitu, která funguje s většinou fluorescenčních mikroskopů a jednotek průtokové cytometrie. Zde prezentované údaje ukazují schopnost LuminiCell Trackerů pro in vitro a in vivo sledování osudu a aktivit buněk pomocí nádorových buněk a ADSC jako modelů, které prokázaly vynikající čas sledování, jehož nelze dosáhnout jinými technikami přímého fluorescenčního značení.

Odkazy

1. Ding D, Mao D, Li K, Wang X, Qin W, Liu R, Chiam DS, Tomczak N, Yang Z, Tang BZ, et al. 2014. Precise and Long-Term Tracking of Adipose-Derived Stem Cells and Their Regenerative Capacity via Superb Bright and Stable Organic Nanodots. ACS Nano. 8(12):12620-12631. https://doi.org/10.1021/nn505554y

2. Li K, Yamamoto M, Chan SJ, Chiam MY, Qin W, Wong PTH, Yim EKF, Tang BZ, Liu B. Organic nanoparticles with aggregation-induced emission for tracking bone marrow stromal cells in the rat ischemic stroke model. Chem. Commun.. 50(96):15136-15139. https://doi.org/10.1039/c4cc06921h

3. Ding D, Goh CC, Feng G, Zhao Z, Liu J, Liu R, Tomczak N, Geng J, Tang BZ, Ng LG, et al. 2013. Ultrabright Organic Dots with Aggregation-Induced Emission Characteristics for Real-Time Two-Photon Intravital Vasculature Imaging. Adv. Mater.. 25(42):6083-6088. https://doi.org/10.1002/adma.201301938

4. Li K, Zhu Z, Cai P, Liu R, Tomczak N, Ding D, Liu J, Qin W, Zhao Z, Hu Y, et al. 2013. Organic Dots with Aggregation-Induced Emission (AIE Dots) Characteristics for Dual-Color Cell Tracing. Chem. Mater.. 25(21):4181-4187. https://doi.org/10.1021/cm401709d

5. Li K, Qin W, Ding D, Tomczak N, Geng J, Liu R, Liu J, Zhang X, Liu H, Liu B, et al. 2013. Photostable fluorescent organic dots with aggregation-induced emission (AIE dots) for noninvasive long-term cell tracing. Sci Rep. 3(1): https://doi.org/10.1038/srep01150

6. Bin Liu, Ben Zhong Tang et al. Photostable fluorescent organic dots with aggregation-induced emission (AIE dots) for non-invasive long-term cell tracing. Nature Sci. Rep. 2013;3:1150. https://www.nature.com/articles/srep01150