Teplota tání oligonukleotidů
Jak se vypočítá Tm DNA?
Teplota tání (Tm) oligonukleotidu je teplota, při které je 50 % oligonukleotidu duplexováno se svým dokonalým komplementem a 50 % je volných v roztoku. Znalost Tm je kriticky důležitá pro řadu technik v molekulární biologii (např. PCR, Southern blotting, in situ hybridizace). Některé z těchto klasických technik se stále hojně využívají ve spojení s novějšími technikami, jako je příprava knihoven vzorků na základě PCR, které mají být použity při sekvenování nové generace.
Nejběžnější experimentální metodou pro stanovení Tm je měření změny absorbance oligonukleotidu s jeho doplňkem v závislosti na teplotě (obrázek 1). Ačkoli experimentálně stanovené hodnoty Tm jsou nejpřesnější, při použití klasických molekulárních technik pro rutinní aplikace nejsou nezbytné.
Obrázek 1. Příklad experimentálního stanovení Tm oligonukleotidu. Měření se provádí v termostatované cele UV-Vis spektrofotometru. Tm je údaj v polovině vzdálenosti mezi plošinou dvouvláknové DNA (dsDNA) a plošinou jednovláknové DNA (ssDNA).
K výpočtu očekávaného Tm lze použít teoretické metody, které zohledňují pravděpodobnou zamýšlenou techniku i faktory ovlivňující tání (koncentrace sekvence, délka sekvence, složení bází, iontová síla atd.).
Teoretické Tm DNA Metody výpočtu
V závislosti na povaze sekvence používáme k výpočtu Tm jednu ze dvou metod:
- Nejbližší sousedé
- Základní
Nejbližší sousedé
Primární metoda, kterou používáme k výpočtu Tm, je metoda, kterou používáme k výpočtu Tm/sub> je metoda nejbližších sousedů1,2 a používáme ji pro oligonukleotidy s délkou sekvence od 15 do 120 bází (horní hranice délky naší standardní nabídky oligů DNA). Tato metoda je považována za nejpřesnější, protože zohledňuje sekvenci oligonukleotidu, a nikoli pouze složení bází jako ostatní metody. Metoda nejbližších sousedů zohledňuje termodynamické i další faktory, které ovlivňují Tm, včetně koncentrace oligonukleotidů a monovalentních kationtů.
Používáme následující modifikovaný vzorec pro nejbližší sousedy:
Kde:
Tm = teplota tání ve °C
ΔH = změna entalpie v kcal mol-1 (zohledňuje změnu energie během žíhání/tání)
A = konstanta -0.0108 kcal K-1 ᐧ mol-1 (zohledňuje iniciaci šroubovice během žíhání / tání)
ΔS = změna entropie v kcal K-1 ᐧ mol-1 (zohledňuje energii neschopnou vykonat práci, tj.tj. neuspořádanost)
R = plynová konstanta 0.00199 kcal K-1 ᐧ mol-1 (konstanta, která škáluje energii na teplotu)
C = koncentrace oligonukleotidu v M nebo mol L-1 (používáme 0.0000005, tj. 0,5 µM)
-273.15 = konverzní faktor pro změnu očekávané teploty v Kelvinech na °C
[Na+] = koncentrace sodíkových iontů v M nebo mol L-1 (používáme 0,05, tj. 50 mM)
Existuje konečný počet hodnot nejbližších sousedů pro ΔH, ΔS.a A, které lze dosadit přímo do výše uvedeného vzorce (tabulka 1).
Tabulka 1. Hodnoty nejbližších sousedů pro ΔH a ΔS. V článku, který slouží jako zdroj základního vzorce pro nejbližší sousedy (odkaz 1), jsou ΔS, A a .R jsou uváděny v jednotkách cal K-1 ᐧ mol-1, takže pro vyvážení jednotek se ve vzorci násobí koeficientem 1 000 ΔH (uváděným v kcal mol-1). Zde uvádíme ΔS, A a R v jednotkách kcal K-1 ᐧ. mol-1 tak, aby se jednotky pro jednotlivé parametry shodovaly, a aby tedy bylo intuitivnější sledovat níže uvedený příklad výpočtu při rozměrové analýze. Bez ohledu na přístup je vypočtené Tm shodné. Kompletní seznam hodnot ΔH a ΔS, včetně hodnot pro wobble sekvence, získáte od naší skupiny technických služeb na adrese [email protected].
| Molekula | DNA | Interakce | ΔH | ΔS | ΔH | ΔS | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| -9.1** | -0,0240 | -6.6 | -0.0184 | |||||
| AT/TA | -8.6 | -0.0239 | -5,7 | -0.0155 | ||||
| TA/AT | -6.0 | -0.0169 | -8,1 | -0.0226 | ||||
| CA/GT | -5.8 | -0.0129 | -10,5 | -0.0278 | ||||
| GT/CA | -6.5 | -0.0173 | -10,2 | -0.0262 | ||||
| CT/GA | -7.8 | -0.0208 | -7,6 | -0.0192 | ||||
| GA/CT | -5.6 | -0.0135 | -13,3 | -0.0355 | ||||
| CG/GC | -11.9 | -0,0278 | -8.0 | -0.0194 | ||||
| GC/CG | -11.1 | -0.0267 | -14,2 | -0.0349 | ||||
| GG/CC | -11.0 | -0,0266 | -12.2 | -0,0297 | ||||
*Levá sekvence je 5' až 3', zatímco pravá sekvence je 3' až 5', např. pro AA/TT je AA 5' až 3' a TT je 3' až 5'. Při výběru hodnot vždy vybírejte ve směru 5' až 3', bez ohledu na to, zda se jedná o levou nebo pravou sekvenci ve správné orientaci.
**Záporné hodnoty odrážejí, že žíhání je entalpicky a entropicky výhodné. Kladné hodnoty by odrážely opačnou reakci, tedy tání, a vedly by k identickému výpočtu Tm
Příklad výpočtu nejbližších sousedů. Tento příklad demonstruje ruční výpočet Tm pro následující sekvenci:
5'-AAAAACCCCCGGGGGTTT-3'
Toto je výše uvedená sekvence spárovaná se svým reverzním komplementem:
5'-AAAAACCCCCGGGGGTTT-3'
3'-TTTTTGGGGCCCCCAAAAA-5'
Krok první:
Přečtení cílové sekvence 5' až 3', hodnoty ΔH a ΔS pro všechny nejbližší sousedy lze nalézt v tabulce 1. Identifikované dvojice nejbližších sousedů spolu s jejich hodnotami ΔH a ΔS (a součty) jsou následující:
| Nejbližší sousedé | ΔH | ΔS |
|---|---|---|
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| GT/CA | -6.5 | -0.0173 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| CG/GC | -11.9 | -0.0278 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 |
| GT/CA | -6.5 | -0.0173 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 |
| Překlad: J. Š.Součet | -185.7 | -0,4672 |
Druhý krok: dosaďte hodnoty do vzorce pro výpočet teploty tání podle nejbližších sousedů
Tm = 69.6 °C
Pro srovnání uvádíme hodnotu stanovenou pomocí online kalkulátoru oligonukleotidových sekvencí:
Ručně vypočtená hodnota 69,6 a hodnota vypočtená online kalkulačkou 69,7 (rozdíl je způsoben tím, že původní literární hodnota plynové konstanty 1,987 byla pro tento příklad výpočtu zaokrouhlena na 1,99).
Hodnota 69,7 by byla uvedena v technickém listu dodávaném s tímto oligonukleotidem.
Základní
Sekundární metoda, kterou používáme k výpočtu T<.sub>m je základní metoda (modifikovaný Marmurův Dotyho vzorec3), kterou používáme pro oligonukleotidy s krátkými délkami sekvencí, tj.tj. ty, které mají 14 bází nebo méně. Tato metoda, částečně odvozená z experimentů s membránovou hybridizací, předpokládá koncentraci primerů 50 nM, koncentraci monovalentních iontů (Na+) 50 mM a pH 7,0. Vzhledem k tomu, že membránové hybridizační experimenty se dnes neprovádějí tak běžně jako před desítkami let, kdy byl tento výzkum původně prováděn, korekční faktor zohledňuje, že oligonukleotid je pravděpodobně volný v roztoku, např. použitý v modernější technice, jako je PCR.
Používáme následující modifikovaný vzorec Marmur Doty:
Tm = 2(A + T) + 4(C + G) - 7
Kde:
Tm = teplota tání ve °C
A = počet adenosinových nukleotidů v sekvenci
T = počet thymidinových nukleotidů v sekvenci
.
C = počet cytidinových nukleotidů v sekvenci
G = počet guanosinových nukleotidů v sekvenci
G = počet guanosinových nukleotidů v sekvenci
i>
-7 = korekční faktor zohledňující v roztoku
Příklad výpočtu podle Marmura Dotyho. Tento příklad bude demonstrovat manuální výpočet Tm pro následující sekvenci:
5'-ACGTCCGGACTT-3'
Krok první: dosaďte hodnoty do Marmurova Dotyho vzorce pro výpočet teploty tání
Tm = 2(A + T) + 4(C + G) - 7
Tm = 2(2 + 3) + 4(4 + 3) - 7
Tm = 31.0 °C
Pro srovnání uvádíme hodnotu stanovenou pomocí online kalkulátoru oligonukleotidových sekvencí:
Hodnota 31,0 by byla uvedena v technickém listu dodávaném s tímto oligonukleotidem.
Pokud hodláte použít tyto krátké oligonukleotidy pro membránové hybridizační experimenty, doporučujeme k uvedené hodnotě Tm ručně přičíst +7 (tj, výše uvedená hodnota by byla 38 °C).
Závěr
K určení Tm oligonukleotidu se používá jedna ze dvou metod, které jsou optimalizovány pro klasické molekulární techniky. V případě potřeby další pomoci se obraťte na naši skupinu technických služeb na adrese [email protected]..
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
