簡介與歷史年表

A Technical Guide to PCR Technologies

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• 邁向定量即時 PCR (qPCR)
• 數位 PCR 發展
• PCR基礎

背景：一種技術的前身

聚合酶連鎖反應 (PCR) 廣泛應用於生物科學研究的所有領域，包括臨床、法醫和診斷領域，PCR 技術的廣泛採用為生命科學研究帶來了革命性的變化。

目前，PCR 被認為是應用於使用分子生物學進行調查的最有用技術。這主要是因為它能夠將目標核酸序列（模板；基因體 DNA、gDNA 或互補 DNA、cDNA）擴大數百萬倍。 

基本技術已經過許多改進，並發展出許多適應性的技術，包括逆轉錄 PCR (RT-PCR)、即時定量 PCR (qPCR)、逆轉錄 qPCR (RT-qPCR) 和數位 PCR (dPCR)。

核酸複製

1971年，Kjell Kleppe 和諾貝爾獎得主 Gobind Khorana 發表了一份技術描述，代表了核酸複製方法的基本原則：

"...... DNA 雙複體會變性以形成單股。此變性步驟會在兩個適當引物充分過量的情況下進行。冷卻後，我們希望能得到兩個結構，每個結構都包含與引物適當複合的全長模板鏈。DNA 聚合酶將被加入以完成修復複製的過程。結果應該是兩個分子的原始雙工。整個週期可以重複，每次都會加入新劑量的酵素。然而，在 DNA 雙工體變性後冷卻時，形成原始雙工體的再變性可能會比模板-二聚體複合物的形成更重要。如果這種趨勢無法透過調整引物濃度來避免，顯然就必須先分離鏈，然後再進行修復複製。在每個修復複製週期之後，都必須重複分離鏈的過程。"¹

儘管這段文字看起來清楚地描述了現在被公認為 PCR 的過程，但在當時卻無法透過實驗來驗證，因為引物設計所需的目標序列並非唾手可得，也沒有方便的方法來製造合成的 PCR 引物寡核苷酸。

PCR 發現

最初，在考慮 DNA 擴增的過程時，Kary Mullis 等人、² 曾假設引物加入到變性的 DNA 中時，它們會被延伸，延伸的產物會從它們的模板中解開，再次加入引物，然後重複延伸的過程。然而，事實並非如此，DNA 在每一輪合成後都必須加熱到幾乎沸騰，才能使新形成的雙鏈 DNA 變性。用於合成的 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段會因高溫而失活，因此正如 Kleppe¹ 所預測的，在每個循環開始時需要更多的酵素。

Taq DNA 聚合酶的突破

導致 PCR 技術被普遍採用的一個關鍵發展，是使用一種熱穩定的 DNA 聚合酶的概念，它可以耐受重複變性步驟的高溫。DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段被耐高溫的 Taq DNA 聚合酶^3,4取代。使用 Taq DNA 聚合酶時，可以在密閉的反應管中進行多輪擴增，而無需補充酶。此外，可以擴增較大的片段，較高溫度的反應也足夠：

• 增加複製保真度，
• 減少非特異性的產物形成，以及
  
• 允許直接在溴化乙锭染色的瓊脂質凝膠上檢測產物^5,6,7。

大約在 1993 年諾貝爾 PCR 大獎頒發的同時，Higuchi 等人也獲得了諾貝爾 PCR 大獎。,⁸ 認識到 PCR 的過程可以透過加入與累積的 PCR 產物結合的螢光標籤來監控。隨著 PCR 產物濃度的增加，螢光信號的強度也會增加。這個發現為現代的即時定量 PCR (qPCR) 舖了路。在目前的 qPCR 技術中，這些螢光信號是透過加入螢光 DNA 結合染料或寡核苷酸探針產生的。螢光 DNA 結合染料，例如 SYBR^® Green I，會被加入 PCR 緩衝液中。當染料在溶液中游离時，它會以振動能的形式釋放出過剩的能量。然而，當 DNA 目標被擴增後，染料會與 DNA 產物結合，並採用另一種構象。這種構象改變會降低分子的移動性，並導致過剩的能量以螢光形式發射出來。因此，與 DNA 結合的染料比未結合的染料具有更高的螢光。監測反應的另一種方法是在反應中加入標記引物⁹ 或者，為了增加特異性，在兩個引物之間加入一個寡聚探針。這個寡聚探針會被標記，在大多數情況下也會被淬滅。有多種探針可供選擇，但最受歡迎的是雙標籤探針（也稱為 TaqMan^®）¹⁰、分子信標¹¹、Scorpions^® 探針¹² 及 LightCycler^® 探針¹³ (見 定量 PCR 和數位 PCR 檢測方法）。

數位 PCR 的發展

最近的 qPCR 發展是數位 PCR (dPCR)，其中將樣品稀釋並分為數百至數百萬個反應室。稀釋和分割必須使每個反應室都包含零個或一個模板拷貝，起始濃度則根據具有陽性信號的反應室與具有陰性信號的反應室之比來估計。Poisson 分佈用來量化目標拷貝。由於目標拷貝被稀釋為單一拷貝，因此 dPCR 特別適用於需要在高濃度野生型序列中量化罕見突變的應用 (see 數位 PCR）。

附加技術

反轉錄的重要性

除了基因組 DNA 序列分析之外，人們長期以來都相信利用 PCR 研究特定的 mRNA 序列可以獲得細胞生物學的重要資訊。研究正常組織與病變組織之間的基因數量變化，或尋找基因表達對藥物治療的反應變化，正被用來了解基因表達的調控如何成為複雜的細胞控制系統的一部分。測量 mRNA 需要額外的逆轉錄 (RT) 步驟，以便將 RNA 轉換成適合 PCR 擴增的 DNA 範本。此步驟會使用逆轉錄酶和一個或多個寡聚引物延伸。反轉錄反應的引物可以是序列特異性引物、沿著 mRNA 長度進行雜交的一系列隨機引物，或針對大多數信使 RNA 序列 3' 端（polyA 尾）的腺苷酸簇的引物。從引物延伸後，會產生 RNA 和 DNA 的雙鏈混合體，稱為第一鏈 cDNA。此 cDNA 是 PCR 和相對 反轉錄）。

microRNA擴增

最近，包括microRNA (miRNA)在內的小型非編碼RNA (ncRNA)家族已被發現。越來越明顯的是，miRNA 分子的表達概況可用作特定疾病的遺傳生物標記。使用 PCR 擴增這些靶點尤其具有挑戰性，因為它們非常小，而且沒有天然的 polyA 尾部。不過，也有分析這些分子遺傳資訊的方法，例如加入人工 polyA 尾部來捕捉樣本中的所有 miRNA，然後對感興趣的靶點進行選擇性 qPCR（見 PCR/qPCR/dPCR Assay Design）。

PCR 基本原理

無論選擇哪種 PCR 技術或應用，理論上，每個 PCR 週期都應該複製一個模板分子。假設每個週期都是絕對、完美的複製，那麼經過 40 輪擴增之後，會產生 2⁴⁰ or 10¹² 個相同的分子 (擴增子)。但是，任何基於 PCR 的檢測的實際靈敏度都是由檢測設計¹⁴決定的，如 PCR/qPCR/dPCR分析設計、樣本品質和分析對抑制劑的敏感性，如 分析優化與驗證。

除了動態範圍之外，以 PCR 為基礎的檢驗的分析靈敏度也取決於資料的變異性。樣品基質中抑制劑的存在、反應中非目標產物的降解和非特異性擴增都是變異性的潛在來源。如果這些情況是隨機或偽隨機地發生在生物樣本中，進行重複測量可將變異性對最終結果的影響降至最低。然而，在某些情況下，變異性可能不是隨機的，而是系統性的。在這種情況下，重複樣本的平均值將無法緩解問題。

此外，為了避免因反應變異所造成的不確定性，在任何實驗中，在所有樣品旁加入一系列對照是很重要的。對於對照的選擇以及是否包含對照，應該始終只取決於研究的性質。科學完整性應該是所有實驗設計背後的驅動因素。如果進行不適當的實驗，甚至可能導致撤銷實驗的結果^15,16，就等於虛耗所有資源。有些對照當然應該被視為必須的，原始資料也應該被呈現以供檢查，尤其是當研究或分析的結果可能會導致生死抉擇時¹⁷。與實驗樣本平行運行的對照被廣泛用於驗證檢測品質和故障排除過程中，如 疑難排解.

MIQE簡介

為了確保報告分析的品質，國際知名的分子生物學專家團隊編寫了The MIQE Guidelines：公布定量 Real-Time PCR 實驗的最低限度資訊¹⁷。這些準則指導研究人員進行檢測品質控制。化驗驗證過程中的控制所衍生的資訊，需要用來確定實驗是否符合 MIQE。作為這些建議出版後的跟進工作，我們對 qPCR 出版物進行了審閱，結果顯示採用這些指南的情況有所增加¹⁸。針對包含 dPCR 實驗所得資料的研究，最近也發表了類似建議¹⁹。

材料

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參考資料

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About A Technical Guide to PCR Technologies

本指南專為具有分子生物學背景的科學家以及其他領域中有興趣了解更多以 PCR 為基礎的技術的科學家所設計。

為了說明理論概念，協議（見 協議），可用於分析樣品品質、最佳化檢驗條件、確定檢驗效率和 RT 線性。這些方案可輕鬆適應所有研究應用。