分子克隆的疑難排解

分子克隆概述

分子克隆用於組合重組 DNA 分子，並在宿主生物體內引導其複製，製造出多個 DNA 分子。克隆包括複製一個分子，以產生具有相同 DNA 分子的細胞群。它通常用於擴增包含整個基因或任何 DNA 序列（如啟動子、非編碼序列和隨機片段 DNA）的 DNA 片段。分子克隆是將有興趣的基因 (GOI) 插入質粒載體，然後將此載體插入能表達 GOI 所編碼蛋白質的細胞中。一旦蛋白質在細胞中表達，蛋白質的表達就可以用於不同的研究（如細胞信號傳遞、形態或其他方面）。

克隆不僅是創建基因或其他細胞組件的拷貝，也是改變 DNA 序列中的基因，然後將其複製。要擴增生物體內的任何 DNA 序列，該序列必須與複製起源相連，並且能夠引導其本身和任何相連序列的繁殖（例如： 快速 DNA Dephos & Ligation Kit  可用於克隆）。

分子克隆的重要性/應用

分子克隆用於以下方面：

• 用於探索蛋白質及其功能。利用重組 DNA，研究科學家可以指導複製（生產重組蛋白質），並利用克隆來操控細胞，從而了解更多關於特定蛋白質的知識，並將這些知識應用於疾病和病原體等更大規模的研究工作中。¹
• 它有助於探索許多不同物種（包括人類和其他動物）的基因組序列，並創造轉基因生物，如抗除草劑植物等。
• 它可用於細胞週期、基因組組織、基因表達和基因治療。
• 由於其簡單性、成本效益、快速性和可靠性，它是臨床微生物學的重要工具。¹
• 利用此技術開發的基因探針在遺傳病的早期診斷、法醫調查和常規診斷中有許多有用的作用。¹

分子克隆的過程

克隆任何 DNA 片段基本上包括以下步驟：

• 選擇克隆載體（例如： PSF-OXB20-FLUC - BACTERIAL LUCIFERASE PLASMID or PSF-OXB20-BETAGAL - BACTERIAL BETA GALACTOSIDASE PLASMID or PSF-OXB20 - STRONG BACTERIAL PROMOTER PLASMID and host organism.如需幫助選擇載體，請參閱我們的 表達載體選擇指南
  
• 製備載體 DNA（例如： GenElute™ Plasmid Midiprep Kit<, Plasmid DNA from E.大腸桿菌 RRI）
• 製備需要克隆的 DNA 片段
• 使用 DNA 連接酵素製作重組 DNA（例如： T4 DNA Ligase）
• 將重組 DNA 導入或插入宿主生物：
• 將 DNA 植入宿主生物體內取決於所選擇的實驗方法（即轉換、轉導、轉載）。e. 转化、转导、转染、电穿孔）
• 选择含有载体序列的生物
• 筛选具有所需 DNA 插入且具有生物学特性的克隆

有关分子克隆的详细文章可在分子生物學手冊。

在分子克隆的過程中，會面臨各種問題，這些問題可以檢查。以下是幾個可能的原因和建議的解決方法：

載體的選擇

在克隆過程中要考慮這四個DNA片段；缺少任何一個DNA片段都可能導致問題：

• 一個DNA複製起源是必要的（用於在宿主內複製）
• 一個或多個獨特的限制性內切酶識別位點（外來DNA可能被引入）
• 一個可選擇的遺傳標記基因，用於使吸收了載體序列的細胞存活
• 附加基因（用於篩檢含有外來 DNA 的細胞）

DNA片段的製備

限制性酵素（RE）消化不完全

• 限制性酵素未完全裂解：需要檢查酵素的甲基化敏感度，使用限制性酵素隨附的建議緩衝液。清理 DNA 以去除可能抑制酵素的雜質。(可使用下列產品，效果更佳)
  
• 鹽抑制：少數酵素對鹽敏感，因此 DNA 需要在消化前清洗。
• PCR組件抑制：在限制性消化前需要清洗PCR片段。
• 使用錯誤的緩衝液：只需要使用隨限制性酵素提供的建議緩衝液。(雙重消化：雙重消化：同時使用兩種限制性酵素消化 DNA 底物稱為雙重消化，是一種常見的節省時間的程序）對於雙重消化，需要選擇正確的緩衝液，使兩種酵素產生最大的活性。應遵循建議的方案。
• 如果使用的酶太少：一般建議每 μg DNA 至少使用 3-5 個單位的酶。
• 培養時間短：需要增加培養時間。

消化後的 DNA 在瓊脂質凝膠上呈現塗片。

• 限制性酵素可能與 DNA 底物結合：需要加入 SDS 0.1-0.5% (例如: 十二烷基硫酸鈉溶液)到上載緩衝液中，使酵素與 DNA 分離。
• 核酸酶污染：使用新的、乾淨的運行緩衝液和新的瓊脂糖凝膠（例如： 瓊脂糖、低膠凝溫度）可能會有幫助，同時還會清理 DNA。

凝膠上的額外條帶或塗片

如果在凝膠中看到比預期大的條帶，這可能表示酵素與底物結合：

退火溫度可能過低：需要確定引物的正確退火溫度。(例如： KiCqStart^® SYBR^® Green引物， 六核苷酸引物 可以使用）。

PCR片段沒有擴增

這可能是由以下原因造成的，需要在實驗中檢查²：

• 使用錯誤的引物序列或 PCR 引物有誤
• 退火和延伸溫度不正確
• 引物濃度不正確和聚合酶單位太少：需要根據反應容量使用製造商推薦的引物濃度和聚合酶單位。
• 反應中Mg²⁺ 濃度、緩衝液pH值和循環條件：  需要對擴增反應進行高度優化。

使用DNA連接酵素製作重組DNA

• 使用最大的連接混合物：需要使用結合反應的推薦量來進行轉換。(舉例來說： QuickLink™ DNA Ligation Kit and ；快速 DNA 結合套組 可用於高效率快速結合。
• 低效連接：確認至少有一個含有 5´ 磷酸分子的片段需要連接。純化 DNA 以去除鹽和 EDTA 等雜質。連接前去除磷酸酶。
• 低效磷酸化：  需要在磷酸化前純化 DNA，以去除可能抑制激酶的過量鹽、磷酸或氨離子：
• 低效的A-Tail：在blunting之前進行熱滅活或去除限制性酵素，以及在blunting之前清洗PCR片段可能會有所幫助：需要在 A-tailing 之前清洗 PCR。高保真酵素會移除任何非模板化的核苷酸）

連接後的 DNA 在瓊脂質凝膠上跑成塗片

• 連接酵素與 DNA 底物結合：需要在凝膠上運行之前用蛋白酶 K（例如： 來自 Tritirachium album 的蛋白酶 K）處理結合反應。

將重組 DNA 植入宿主生物

• 如果細胞無法存活：需要計算合格細胞的轉換效率，或使用市售的高效能合格細胞。例如： SIG10化學能勝任細胞 (CMC0001) 擁有高轉換效率的&>1 x 10⁹ cfu/μg
• 感興趣基因 (GOI) 可能對細胞有毒：需要在較低溫下培養平板，或使用對 DNA 片段或感興趣基因有較強轉錄控制的菌株。例如： CONTROLLER SIG10 Chemically Competent Cells 可以使用。
• 如果使用了錯誤的熱震盪協議（用於化學合格細胞）：需要遵循製造商的特定轉換方案，在熱震盪期間使用建議溫度會有幫助。
• 如果接合混合物中存在 PEG（用於電子能力細胞）：
• 如果電泳細胞中沒有電壓：需要在結合步驟前清洗DNA，並去除任何氣泡。需要遵循製造商指定的電穿孔參數。
• 建構的 DNA 過大：需要選擇能夠有效轉換大型 DNA 建構物的合格細胞株，或使用電穿孔法。例如： XLDNA SIG10 Electrocompetent cells 可用於大型建構和增加 DNA 產量。
• 建構可能易於重組的 DNA 片段：  需要檢查。例如： STEADY Chemically Competent Cells 可以使用。
• 用於選擇含有載體序列的生物，可選擇性標記（通常一個基因是必不可少的）賦予對抗生素的抗性：需要確認抗生素並優化其濃度。還需要確認載體使用的選擇標記。例如 Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus 可以用作標記。請參閱下表，其中包含一些抗生素的例子及其工作濃度。

表 1.一些常用的抗生素、其機制和一般工作濃度。

抗生素名稱	類別	作用方式*	種類	氨基糖苷類	結合 30S 核糖體亞單位；導致錯誤轉譯	殺菌作用	100毫克/升
Spectinomycin (Product No. S4014）	氨基糖苷類	結合 30S 核糖體亞單位；中斷蛋白質合成	殺菌作用	7.5-20 mg/L
Ampicillin (Product Nos. A6140, A6140, A9393 and A9518)	beta-lactam	抑制細胞壁合成	殺菌	20-60 µg/mL
Carbenicillin (Product No. C3416）	beta-內酰胺類	抑制細胞壁合成	殺菌	100微克/毫升
Bleomycin (Product No. B5507）	甘肽	誘導 DNA 斷裂	殺菌	10-100μg/mL
紅黴素 (Product No. E6376)	macrolide	阻斷 50S 核糖體亞單位；抑制氨基酰轉移	抑菌	50-200mg/L
多粘菌素 B (Product No. P1004)	多肽	抑制外膜通透性	殺菌	10-100µg/mL
四環素 (Product No. T3383)	四環素	結合 30S 核糖體亞單位；抑制蛋白質合成 (延伸步驟)<	抑菌劑	10毫克/毫升
氯霉素 (Product No. C0378）		結合 50S 核糖體亞單位；抑制肽基轉移	抑菌	10-20 µg/mL
*在原核生物中。 **除非另有說明，否則應溶解於超純水中並進行無菌過濾。

除了《疑難排解指南》中所示的可能原因外，以下問題也可能與轉換效率低或無轉換效率有關，可以進行檢查。

• DNA中的雜質：使用化學能幹細胞時，需要去除DNA溶液中的酚、蛋白質、去垢劑和乙醇（即。e. BL21(DE3))。當使用電動穩定性細胞時，乙醇會在連接過程中沉澱，以清理質粒 DNA。BL21(DE3)  （因为盐和缓冲液会强烈抑制电穿孔并增加电弧风险）。
• DNA或容量過多：這需要檢查，根據使用的細胞類型，只需要準備建議的容量。
• 抗生素抗性低或表達不良：表達時建議使用 S.O.C. 培養基，而不是 LB 培養基，因為它會使轉換效率降低 2-3 倍。
• 合格細胞的正確儲存和處理：將合格細胞儲存於 -80 °C 而非液氮中。能力細胞解凍後應立即使用，並在使用前保持冰冷。盡量減少凍融週期的次數。
• 細胞生長緩慢或無生長或過度生長：使用建議的溫度可能有助於細胞的正常生長。
• 計算不正確：確保使用正確的稀釋因子和 DNA 數量來計算效率。

克隆篩選

沒有質粒的菌落：

• 使用的抗生素量不足： 需要增加平板上的抗生素含量至建議用量，使用含有新鮮抗生素的新鮮平板可能會有幫助。請參考表 1。
• 衛星菌落的選擇：
  （衛星菌落是在抗生素耐藥菌落周圍生長的非常小的細胞菌落，它們吸收了錯誤的質粒。抗生素耐藥性菌落會釋放降解抗生素的酵素。衛星菌落轉移到新的培養基後不再生長，因此不做進一步分析。)

含有錯誤/不正確構造物的菌落可能是由於：

• 質粒（載體）的重組
• 克隆時使用的PCR擴增子不正確：需要優化PCR條件。
• 存在內部識別位點：需要分析插入序列是否存在內部識別位點。
• 序列中存在突變/錯誤：
  • 使用低保真 DNA 聚合酶：例如使用具有 Proofreading 活性的高保真 DNA 聚合酶：
  • 在從凝膠切除過程中被紫外線破壞的DNA：在從瓊脂糖凝膠中切除 DNA 時，建議使用長波長 UV (360 nm) 光箱。

PCR克隆的注意事項

• 所用插入物或片段的性質：由於片段大小、插入物毒性和插入物複雜性的不同，PCR片段的效率也不同。
• 插入片段的大小：小片段的 DNA 被認為是高效率的。
• 載體與插入片段的比例：  優化載體與插入片段的摩爾濃度比例對於高效率的克隆是非常必要和關鍵的。
• 使用乾淨的 PCR 產品：建議使用乾淨的 PCR 產品，在某些情況下使用新鮮的產品會有幫助。(例如： rAPid Alkaline Phosphatase 可用於去除 dNTPs 以清潔 PCR 產品）。
• 陽性和陰性對照的使用：擁有適當的陽性和陰性對照對於評估克隆事件的結果是非常重要的。
• 載體和插入物的DNA末端的相容性：這需要檢查，為了成功克隆，使用正確的聚合酶和克隆載體是很重要的。使用 SnapFast™ 向量使克隆更有效率和容易，因為它使 DNA 從一個向量移動到另一個向量變得容易。
• 正確設計正向和反向 PCR 引物以及探針至關重要。

參考資料

1. Sharma K, Mishra AK, Mehraj V, Duraisamy GS. 2014. Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 30(1):65-78. https://doi.org/10.1080/02648725.2014.921501

2. Roux KH. 2009. Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbor Protocols. 2009(4):pdb.ip66-pdb.ip66. https://doi.org/10.1101/pdb.ip66

3. Raso A, Mascelli S, Nozza P, Ugolotti E, Vanni I, Capra V, Biassoni R. 2011. Troubleshooting fine-tuning procedures for qPCR system design. J. Clin. Lab. Anal.. 25(6):389-394. https://doi.org/10.1002/jcla.20489

4. Canene-Adams K. 2013. Explanatory Chapter.271-278. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-418687-3.00022-7

5. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. JoVE.(63): https://doi.org/10.3791/3998

6. Fulton TL, Stiller M. 2012. PCR Amplification, Cloning, and Sequencing of Ancient DNA.111-119. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-516-9_15

7. Mergulhão F, Kelly A, Monteiro G, Taipa MA, Cabral JM. Troubleshooting in Gene Splicing by Overlap Extension: A Step-Wise Method. MB. 12(3):285-288. https://doi.org/10.1385/mb:12:3:285

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