PCR技術技術指南
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優化 PCR 條件
即使使用預先設計並在市場上取得的檢驗方法，檢驗方法的優化和驗證也是必要的。需要進行優化，以確保檢測具有所需的靈敏度，並且對感興趣的目標具有特異性。例如，病原體偵測或罕見 mRNA 的表達剖析需要高靈敏度；SNP 偵測需要高特異性，而病毒定量則需要高特異性和高靈敏度。需要高特異性的檢測在沒有經過最佳化和適當控制的情況下特別容易發生問題。同樣地，當要在多重反應中同時檢測多個目標時，必須優化檢測條件以同等檢測所有目標。
有許多因素可以改變，以獲得最佳的檢測效能，進而提高分子敏感度、特異度和精確度。從熟練的商業供應商處購買的檢測仍需要在使用的實驗室中進行驗證。與檢測性能相關的聲稱應在研究條件下進行驗證，包括測試樣本、特定試劑和所選儀器。
分析方法的設計必須符合所有理想的設計標準（PCR/qPCR/dPCR 分析設計）可能在各種條件下都有良好的表現。然而，所有的檢測都有一套最佳條件，而這些條件取決於儀器、所選試劑（緩衝液條件）、引物濃度和/或退火溫度 (Ta)、鎂濃度甚至是斜率。由於通常是在選定的儀器和標準緩衝條件下執行檢測，因此大多數的優化程序都集中在使用引物濃度或退火溫度 (Ta)/ 熔解溫度 (Tm) 來修改引物結合動力學。
無論目標是 DNA (qPCR) 或 RNA (RT-qPCR)，以下初步步驟將有助於確保成功量化：
- 驗證引物設計
- 最佳化引物濃度
- 最佳化引物退火溫度
- 優化探針濃度
- 優化反應組份和多重條件
- 使用標準曲線和熔融曲線分析驗證性能
驗證引物設計
當採用先前出版的引物或使用商業提供的檢測時，引物設計的驗證尤其重要。引物設計可以根據 PCR/qPCR/dPCR Assay Design 中提供的檢測設計指南進行審查。關鍵是要確保：
- 引物與所需的目標序列同源。
- 反向互補引物正確無誤。仔細檢查反向互補基序（使用 http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html）。
- 檢測到適當的剪接變異。
- 除非檢測需要，否則避免了SNPs。
- 寡聚體和擴增子沒有採用次級結構。
- 反應的寡聚體彼此雜交的可能性很低。
引物二聚體
引物互相雜交的能力，尤其是在 3'- 端，可能會導致引物在 PCR 過程中延伸，並形成與目標無關的產物，稱為引物二聚體。每當引物二聚體產物產生並進行擴增，它們就會將反應成分從所需產物的合成中分流出來，從而降低檢測效率和靈敏度。因此，在使用探針檢測和 SYBR Green I 染料檢測的反應中，引物二聚體都是一個問題。在使用染料檢測（如 SYBR Green I）時，引物二聚體也會影響檢測的特異性，因為非特異的 DNA 結合染料會與引物結合，並與所需的產物一起被檢測出來。因此，應避免使用可能形成引物二聚體的引物。
引物二聚體預測
若要判斷引物二聚體形成的可能性，請使用引物設計軟體分析雙重體的形成。 OligoArchitect 提供了自二聚体和交叉二聚体杂交强度的详细信息（图 9.1）。引物與自身或與伴侶雜交形成的任何 3'-terminal 二聚體都必須非常弱（ΔG ≥ -2.0 kcal， 圖 9.1）。
如何減少引物二聚體？
應該避免任何同時具有末端 ΔG < -2.0 kcal 和可延伸 3'-end (5'-overlap) 的引物。最強的整體二聚體應該是不穩定的（ΔG ≥ -6.0 kcal）。為了在保持特異性的同時避免強的 3「- 末端二聚體，請選擇在最後 5 個基序有 2 個 G 或 C 殘基、最後 3 個基序有 1 個 G 或 C，以及在 3」- 末端有一個 A 或 T 的引物（圖 9.1）。
圖 9.1.分析引物的引物二聚體潛力。使用 OligoArchitect 設計軟體分析引物序列，以確定其形成雙重體的能力。顯示了最佳引物選項的自身二聚體和交叉二聚體潛力。 如果反應中的所有引物具有相似的熔化溫度 (Tm 差異 ≤ 2 °C)，並且不會形成強的 3'-duplexes (ΔG ≥ -2.0 kcal)，多重 qPCR 將會得到最好的結果。
優化引物濃度和退火溫度 (Ta)
使用引物濃度優化檢測條件時，會選擇固定的 Ta （通常是 60 °C），然後獨立處理每個引物的最佳條件。這在設計多重測試時非常重要，因為所有的反應都必須在相同的退火溫度下進行，這也是一種策略，可用於挽救表現不佳的測試，因為沒有替代設計。技術上較簡單的方法是選擇固定的引物濃度，然後優化 Ta 選擇這些引物組合的最佳結果。這是使用多種檢測方法和dsDNA結合染料檢測（如SYBR® Green I）時的首選方法。不過，這種方法需要一台可以同時運行不同Ta 選項的反應程式的儀器。
優化引物濃度
使用探針式 qPCR 時，引物的最終濃度為 500 nM，探針的最終濃度為 250 nM，通常可以獲得令人滿意的結果，尤其是在 PCR 目標物質豐富且不需要最高靈敏度的情況下。在使用 SYBR Green I 染料檢測以減少非特異性擴增和優化多重反應時，引物濃度通常會稍低一些，介於 200 nM 和 400 nM 之間。要驗證標準條件是否適合使用，請進行標準曲線分析（請參閱 分析評估）。
如果檢測是線性的、可重複的，並且在樣品中預期的目標濃度範圍內梯度在 -3.2 和 -3.5 之間，則可能不需要進一步優化引物和探針的濃度。
檢測沒有得到良好優化的一些跡象是；它在複製品之間缺乏重複性，並且通常效率低、不靈敏。分析性能通常在引物濃度範圍內進行測試，例如，從 50-800 nM，在每個濃度下使用每個引物（圖 9.2；完整的協議請參閱 Appendix A，Protocols; Primer Optimization）。
圖 9.2.引物最佳化範例。用於稀釋和分配引物的 8 管條（頂部和左側）和 PCR 板的佈局。
選擇產生最低 Cq、 最低複製變異和負 NTC 的濃度組合（圖 9.3）2.
。
圖 9.3.來自 SYBR Green I 染料試驗的 PCR 引物濃度最佳化結果。A) 既定指南建議測試各種正向 (F) 和反向 (R) 引物濃度。在本例中，50 nM 至 600 nM 的組合進行了測試，以確定檢測的最佳濃度。在這個實驗中，不同引物濃度造成的 Cq 差異極大，說明這會如何影響最終的數據（資料來自 Jens Stolte，EMBL）。B) 本實驗展示了設計良好的實驗的最佳化，以及引物濃度造成的變異性。400 nM 的正向和反向引物組合被選為最佳組合，因為此組合代表最低的引物濃度，可重複產生最早的 Cq 值，同時保留乙型曲線。
如果多重反應中某一靶點的含量明顯高於其他靶點，或者如果某對引物產生的 Cq 遠低於其他靶點，則該靶點的擴增可能會在反應中佔主導地位，在檢測到其他靶點之前就耗盡了反應組份。調整引物的濃度可以讓所有目標的擴增更平衡。若要判斷此類調整是否有益，請製備標準曲線（請參閱 分析評估），涵蓋單獨使用每對引物（單倍）和結合所有引物（多倍）的預期目標範圍。如果多重反應和單重反應的結果相似，則引物濃度是合適的。另一方面，如果多重反應的靈敏度無法接受，優化引物濃度可能會改善結果。對於產生低 Cq 值的引物對，可降低引物濃度；對於產生高 Cq 值的引物對，可增加引物濃度，範圍在 50-500 nM 之間。
優化引物退火溫度
定量 PCR 分析一般使用兩步或三步溫度循環程式進行，通常有 35-40 個循環。兩步反應在兩個溫度之間循環，通常是 95 ℃（通常為 10-15 秒）和 60 ℃（通常為 30-60 秒或快速條件下為 5-10 秒）。當進行雙標示探針（TaqMan 或水解）檢測時，會選擇兩階段溫度反應，因為較低的溫度延長會促進 DNA 聚合酶的外切酶活性，阻止探針移位。這會是在相同參數下執行許多不同檢測時最受歡迎的「循環條件」協議。不過，使用兩步法的缺點是減少了引物設計的潛在選擇，並將檢測最佳化限制在引物濃度而已，因為無法進行退火溫度 (Ta) 最佳化。
當目標序列複雜，且所選引物難以最佳化，或使用中的檢測系統不依賴使用水解探針時，三步法循環方案較為可取。三步策略在以下兩者間循環95 °C (通常為 10 秒)、退火溫度 (55 °C 至 65 °C 之間，通常為 10-20 秒或快速條件下為 5 秒) 及 72 °C (通常為 20-30 秒或快速條件下為 15-20 秒)。在這種情況下，Ta 可使用下列方案進行最佳化，以進一步改善檢測效能：
- 從待測 Ta 範圍的低端開始（這由引物的 Ta 決定），以漸進的方式逐步升溫（通常在 55 °C 至 65 °C 之間測試）。
- 如下所述，使用 PCR 後熔融曲線分析或瓊脂糖凝膠電泳測試每個反應產物的特異性。
- 最佳退火溫度是能使 Cq 最低、NTC 為負值、熔融曲線分析顯示檢測到特異性產物，以及複製反應之間重現性高的溫度。
如果退火溫度太低，反應會是非特異性的。但是，如果溫度過高，嚴格度可能會影響反應效率，導致缺乏擴增或出現非常高的 Cq 值，產率非常低，重現性也很低。
溫度優化的一個例子顯示在 圖 9.4.中（圖 9.4A），相同的反應在梯度 PCR 區塊上運行，使退火溫度在 47.8 ℃ 和 71.7 ℃ 之間。在 64.8 ℃ 和 61.7 ℃ 退火會產生相同的 Cq 值，但稍低的溫度會產生更高的產物產量，這可以從更高的終點螢光和明顯更高的反應效率（由擴增圖的梯度顯示）得到證明。效率的絕對判定需要標準曲線評估（見 評估）或使用單管效率判定演算法3,4。圖的第二部分（圖 9.4B）顯示引物在相同反應條件下但在不同試劑混合液中的行為比較。這裡很明顯，緩衝液的組合會影響檢測的重現性及獲得穩定數據的溫度範圍。最後，針對相同的目標基因設計了兩種獨立的檢測方法，並在每種緩衝液中進行了優化。如圖 9.4C所示，每種緩衝都需要不同的最佳溫度，才能從兩個引物對（LuminoCt 中為 61.7 °C，KiCqStart 中為 58.4 °C）產生可比的 Cq data 。
圖 9.4.使用 Ta 優化引物。A) 對相同的反應測試了一系列退火溫度。在 64.8 ℃ 和 61.7 ℃ 退火會產生相同的 Cq 值，且複製品之間的重複性很高，但溫度稍低會產生較高的產物率。B) 在不同的試劑混合液（LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 或 KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™）中設置兩個相同的反應，並進行引物溫度梯度運行。每種混合物的最佳溫度都不相同，用 KiCqStart 試劑進行反應時，數據之間的差異較小。C) 在不同的反應混合物中運行對同一目標（KS，使用 Beacon Designer 設計，BD）的兩對引物。可以看出，不同試劑的最佳退火溫度不同（LuminoCt 為 61.7 °C，KiCqStart 為 58.4 °C），引物產生的結果相似。
儘管大多數商品化檢驗都提供標準 PCR 檢驗條件，但個別檢驗可能需要進一步優化，以找出特定引物組合的特異性條件。這可能是由於引物二聚體、非特異性擴增或在所選默認條件下的次優反應效率。優化完成後，應將所選條件應用於測量一系列標準品並製備標準曲線（分析評估），以計算分析效率。
即使經過優化，效率仍有可能未達最佳，在最壞的情況下，可能需要進行新的檢測。
在開始優化過程之前，使用者應定義可容許的效率值範圍。理想情況下，效率應為 >95%。然而，使用效率為 90% 的檢測方法也有可能進行精確的測量，就像引物設計一樣，目標序列可能決定目標無法以更高的效率進行擴增。儘管如此，當使用效率較低的檢測方法時，精確度和檢測限可能會受到影響。
優化探針濃度
大多數檢測可使用 250 nM 探針的最終濃度。但是，如果不需要最高靈敏度，使用較低濃度的探針就足夠了，從而降低檢測成本。為了最佳化探針條件，可在 50 到 500 nM 終極濃度的幾種濃度下進行測試，並結合最佳化濃度的引物和預期會包含在最後實驗中的最低濃度的目標核酸。可使用能達到最靈敏檢測（Cq ≤ 30 且重現性最佳）的最低探針濃度。
優化反應組件和多重檢驗
有些檢驗對緩衝液/反應條件特別敏感。對於這些檢測，通過優化 MgCl2 濃度、添加 PCR 增強劑（Mueller in PCR Technologies; Current Innovations, 20135）或調整儀器斜坡速率來進一步修改反應緩衝液，可以提高性能。除了前面幾節提供的檢測優化指南外，這些因素在優化多重反應時尤其重要。
優化 Mg2+ 濃度
鎂在 PCR 中扮演多種角色。它是 dNTPs 所需的二價陽離子反離子，也是所有聚合酶的輔助因子。二價陽離子會強烈影響 DNA 雙鏈雜交。增加鎂濃度可提高 DNA 雙複體的穩定性或熔解溫度。因此，高含量的鎂會增加引物對雜交的親和力，包括錯誤引物事件和引物與引物的互動。錯誤引物的 DNA 複合物會成為 DNA 聚合酶的底物，實際上會產生副產品並降低 PCR 的效率。因此，MgCl2 的濃度對 PCR 的特異性和產量都有影響，因為鎂會影響引物與目標物的雜交、Taq DNA 聚合酶的處理能力，以及在 qPCR 中用於探針裂解時，外切酶分子的水解速度。因此，MgCl2 不足會導致 DNA 聚合酶聚合速率低、引物結合受影響以及探針裂解效率低，從而導致產率低。如果 MgCl2 的濃度太高，反應的特異性就會受到影響，因為這會導致非特異引物雜交的穩定性提高。
與使用 1.5-2 mM 標準 MgCl2 濃度的傳統 PCR 分析相比，水解探針 qPCR 分析需要約 3-5 mM 的較高濃度，才能達到探針的有效裂解。MgCl2 的存在還能增加 DNA 的雜交速率，使其在許多儀器使用的快速週期條件下進行高效雜交。當進行多重反應時，MgCl2 濃度的最佳化變得更加重要。
鹽，例如 KCl 或 (NH4)2SO4,m， 但這些單價陽離子的影響沒那麼劇烈。
圖 9.5.鎂濃度的影響。
圖 9.5所示的效果在執行多重 PCR 時會被放大。同时运行多个反应会引入试剂竞争，并加剧任何次优条件，从而导致 PCR 效率发生重大变化。
斜率
在极少数情况下，困难的反应需要进一步修改。當所有其他選擇都已經用盡時，可能可以透過經驗測試和修改 PCR 斜率來挽回失敗的局面。
探針螢光團與淬火劑的選擇
執行多重分析時，最大化不同螢光團多重發射的光譜分離以利於信號分離與資料分析也很重要。因此，具有狹窄、解析度高且分離範圍大的螢光團對於多重應用非常有用。然而，在現實中，螢光團的選擇受到儀器光學系統的限制。 定量 PCR 和數位 PCR 檢測方法 包含更多關於螢光團和淬火劑選擇的資訊。
Guidelines for Optimization of Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR)
在進行 RT-qPCR 時，不僅要考慮之前討論過的標準 qPCR 的指導方針，並按照 反轉錄中的討論優化 RT，還要針對 RT 步驟特有的以下幾點進行優化：
- 驗證 RNA 品質（樣本純化和品質評估）。
- 確認引物跨越或側翼長內含子（PCR/qPCR/dPCR Assay Design）。
- 優化逆轉錄（Reverse Transcription）。
- 驗證無逆轉錄酶（No-RT）對照數據。
確認引物跨越或包抄長內含子
雖然在 RNA 純化過程中，樣本中的大部分 gDNA 都會被去除，但沒有任何程序能去除所有 DNA。由於 PCR 能夠擴增單一分子的 DNA，因此在使用 RT-qPCR 時，污染的 DNA 會和 RNA 一樣被擴增。如果目標 mRNA 相當豐富（每個細胞有數百或數千個拷貝），則雜質 DNA 擴增所產生的信號與 RNA 的產物相比可以忽略不計；但是，如果目標 mRNA 中等豐富或稀少（100 個拷貝/細胞），DNA 擴增所產生的信號可能會導致 mRNA 水平的估計值過高。為了避免在 RT-qPCR 過程中產生 DNA 擴增，在可能的情況下，請使用 mRNA 序列中沒有的內含子側邊引物，或是跨越外顯子結合點的引物 (PCR/qPCR/dPCR Assay Design）。
如果感兴趣的基因不包含内含子，如果内含子位置未知，或者如果没有合适的引物跨越或侧翼内含子，可能需要用无 RNase 或扩增级 DNase I 消化输入的 RNA。
驗證不含逆轉錄酶（No-RT）的對照數據
無論引物是否跨越或側接內含子，RT-qPCR 分析的特異性都應該在不含逆轉錄酶（No-RT 對照）的對照反應中進行測試，以評估來自污染 DNA 的潛在擴增。如 PCR/qPCR/dPCR Assay Design所述，具有短內含子（≤1 kb）的 DNA 序列可在 RT-PCR 中成功擴增。許多基因都有缺乏一個或多個內含子的附加拷貝或假基因。因此，DNA對RT-PCR檢測結果數據的貢獻應通過進行包含RNA樣本但不含RT酶的反應，以及同時包含RNA和RT酶的反應（圖9.6）來檢測。在 qPCR 中，如果無 RT 反應的 Cq 值比含有 RT6 的反應的 Cq 值大至少 5 個週期，DNA 擴增即被視為可接受。但是，如果有 RT 和無 RT 反應的 Cq 值之間少於 5 個週期，DNA 擴增可能有助於 mRNA 定量。
圖 9.6. 評估無 RT 對照。在有 RT 酶（+）或無 RT 酶（-）的情況下產生的 RT-PCR 產物在 TBE 中經溴化乙锭染色的 2% 琼脂糖凝膠上分離。A 中 mRNA 目標的引物位於 1 kb 內含子的側邊。B 中的 mRNA 目標與幾個基因對齊，其中至少有一個基因是假基因，在 RT-PCR 使用的引物之間缺乏內含子，因此在使用和不使用 RT 酵素的情況下，會產生相同大小的產物。
當 RNA 的 DNA 污染對實驗造成顯著信號貢獻時，RNA 應在 RT-qPCR 前使用不含 RNase 或擴增等級的 DNase I 消解，以進行可靠的 mRNA 定量。請注意，柱上 DNase 消解（許多市售 RNA 純化試劑盒提供的一種程序，在 RNA 與矽膠柱結合時進行 DNase 消解）在消除 DNA 方面的效果不如從柱上洗脫 RNA 後在溶液中進行消解。因此，柱上 (OC) DNase 消化可能不足以進行 RT-qPCR（圖 9.7）。應使用 DNase 消化的 RNA 進行 No-RT 對照，以驗證消化是否成功和充分。在 圖 9.7所示的例子中，OC DNase 消化足以可靠地檢測目標 mRNA。
請注意，不同類型的細胞和組織，以及不同的生長條件，會產生明顯不同濃度的特定 mRNA。此外，不同的 RNA 純化方法會產生不同數量的污染 DNA。因此，在使用每種新的起始材料、RNA 製備方法或檢測時，應至少進行一次有反轉錄和無反轉錄的反應。
圖 9.7.比較柱上 DNase 消解 (OC) 與製備後 DNase 消解。使用我們的 GenElute™ Total RNA Kit 或另一供應商提供的柱上純化程序，從 30 mg 的小鼠肝臟製備總 RNA，兩者均依製造商的說明進行。兩份 RNA 樣本使用製造商各自的柱上 DNase 產品製備，另兩份則未經 DNase 消解。純化後，四份未使用柱上 DNase 製備的 RNA 樣本的等分樣本依照製造商的說明，使用我們的擴增等級 DNase I 進行消化。在一步式 RT-qPCR 中使用等比例的所有 RNA。圖中顯示了其中兩個 RNA 樣本的螢光圖。兩個製造商的產品都得到了相似的結果，只有需要純化後 DNAse 處理的程序才能去除所有 gDNA。
分析評估
一旦優化了分析，確定了最敏感的條件，確定分析的特異性、效率和技術動態範圍就非常重要了。
使用熔融曲線分析來確定特異性
特異性可以使用熔融曲線分析來確定。進行熔解曲線分析需要加入報告染料（如 SYBR Green I 染料）或使用非水解探針（如 Molecular Beacon 或 Scorpions®）。 Probe (see 定量 PCR 和數位 PCR 檢測方法）。在 qPCR 過程中產生擴增片段後，會在越來越高的溫度下進行培養，溫度通常在 55 °C 至 95 °C 之間。不過，使用者應確認其擴增子的理論熔點是否在此範圍內，因為這將取決於其大小和 GC 含量。實驗中的 Tm 在不同的運行和試劑之間會略有不同，主要是由於 MgCl2 和其他離子濃度的變化造成的。
螢光的變化被確定並繪製成螢光變化率 vs. 溫度。由於 SYBR Green I 是一種非特異性染料，可與任何雙鏈 DNA 結合，因此使用此檢測化學方法時，必須確認 qPCR 只產生所需的產物。熔融或解離曲線分析可用於確定產物的數量和大致大小。特異性高的檢測在僅含目標物的反應中會在高溫下產生單一熔融峰，而在無模板對照中無檢測到或很少檢測到（圖 9.8A）。如果熔融曲線有一個以上的主要峰值，如 圖 9.8B 和 9.8C所示，則可以通過在溴化乙锭染色的瓊脂質凝膠上分離它們來進一步研究產物的特性。如 圖 9.8D 和 9.8E所示，反應 B 和 C 含有過量的引物二聚體或其他非特異產物。降低引物濃度通常會減少非特異產物的數量。如果在引物濃度較低的情況下仍檢測到大量的非特異產物，最好重新設計引物。
圖 9.8.熔融曲線的評估。熔融或解离曲线显示特异性产物在 >80 °C 时出现尖锐的峰值，而在较低温度下只有极少量的非特异性产物（A）或大量的非特异性、较低熔融产物（B 和 C）。D 至 F 分別顯示熔解曲線 A 至 C 所示的 PCR 結果，並在溴化乙锭染色的 2% 瓊脂糖凝膠上分離。
圖 9.9. 在 圖 9.9A中，測試反應中有明顯的特定產物，而在 NTC 中則有較小的產物，在較低溫下熔化。這表示在沒有模板的情況下形成引物二聚體。這是常見的現象，只有當這些引物二聚體產物在測試樣本中明顯存在時，才會引起關注，如 圖 9.8. 圖 9.B 中的例子所示。9B 中的示例顯示了使用同樣的檢測方法（在本例中，引物位於跨越內含子的外顯子）檢測DNA樣本中未加工的gDNA基因，該檢測方法也曾用於mRNA檢測。這兩種產品可藉由其熔解剖面加以區分，gDNA 產品的熔解溫度較高，因為它也包含內含子。
圖 9.9.熔融曲線分析範例 A) 無模板對照中的引物二聚體，B) 跨 gDNA 內含子的擴增。
在設計基因分型的檢測方法時，特異性是非常重要的。這些檢測通常是探針檢測，需要分辨單個碱基的差異，例如區分單核苷酸多態性 (SNP)。在這種情況下，必須在單一反應中針對已知包含特定匹配序列和錯配序列的模板測試每個探針。
效率和檢測限的確定
測量檢測性能的最有效方法是利用模板的序列稀釋建立標準曲線。檢測效率可以標準曲線梯度的因子來測量。
任何合適的模板材料都適合這些技術性的檢測性能測定。選擇標準、可轉移的參照材料可進行實驗室間和實驗室內的驗證。因此，此階段的驗證可使用線性化或缺口化的質粒（超捲曲的 DNA 無法有效擴增，且重現性低）、克隆片段或合成寡核苷酸。
根據標準曲線確定檢測的技術動態範圍和效率的方法如 圖 9.在這個例子中，模板經過 11 logs 的 10 倍系列稀釋，因此理論上的檢測極限顯示為 3 copies (最低 Cq)，不過這個測量的精確度顯然是由可重複性決定的，在如此高的循環下，可重複性相對較低。
圖 9.10.使用線性化質粒的序列稀釋進行高重現性及大範圍檢測的範例。每個稀釋株進行 8 次重複，並使用 SYBR Green I 染料檢測目標物的擴增。可在 3×1010 和 3 個拷貝之間進行定量。
檢測效率是通過測量標準曲線的梯度來確定的，該曲線是目標濃度的對數對 Cq (圖 9.10)。效率為 100% 的檢測會在每個週期顯示加倍 (E=2)，梯度為 -3.323。
效率可根據公式計算：
效率 = 10(-1/slope) -1 。 註： 許多儀器的軟體提供效率測量的百分比
。此值是 E=2 的百分比；因此，效率為 95% 等於 E=1.9
斜率 = m，由公式 y=mx+C 的標準曲線決定。
C是y軸上的理論截距，提供了檢測靈敏度的相對測量。
斜率在 -3.1 和 -3.6 之間會導致效率介於 90% 和 110% 之間，通常是可以接受的，但重要的是要在檢測允許的範圍內盡量接近 100%。圖 9.11 中提供的數據說明了一系列不同檢測的效率和靈敏度的正常變化範圍。這說明了在出版物1,6-8中報告這些數據的重要性。
圖 9.11.效率测定和比较几个潜在参考基因的示例。可以看出，這些基因的效率和靈敏度大不相同（數據由參加 EMBL 進階 qPCR 研討會的學生提供）。
有人提出了標準曲線效率計算的替代方法。這些方法報告試管內單次反應的效率。這些方法依賴演算法來建立擴增圖譜曲線模型，因此取決於螢光增加的週期數。當使用 DNA 結合染料或 Scorpions® 探針進行測量時，這些方法最有可能成功，因為這些檢測方法每個週期的螢光變化較大。雖然這類方法有可能成為標準曲線的理想替代品，但後者仍是更常用的檢測評估方法。
R2值或數據在標準曲線直線上的擬合程度是重現性的量度，受移液精度和檢測的動態範圍影響。因此，在評估檢測時，每個稀釋度至少使用三個技術複本是至關重要的。如果 R2 ≤0.985，該檢測可能無法提供可靠的結果，因為複製品之間的重現性很差。如果輸入核酸最低水平的一個或多個點偏離了圖表的線性區域，則測量濃度很可能超出了檢測靈敏度。如果輸入核酸最高拷貝數的一個或多個點偏離了圖表的線性區域，很可能是反應飽和，目標物濃度超出了有用的檢測範圍。另外，如果幾個隨機點都在線的上方或下方，則可能是移液精度或檢測優化出現了問題。
標準曲線是驗證多重反應的重要工具。同時運行多個反應會引入試劑競爭，並使任何非最佳條件惡化，從而造成 PCR 效率的重大變化。兩個引物/探針目標的效率曲線分別在單獨反應和多重反應中進行。該圖顯示，雖然單獨反應（深藍色和綠色線）的效率和靈敏度（y軸值）相對類似，但同時進行兩個反應會顯著改變多重反應的靈敏度和效率。
圖 9.12.Singleplex Reaction vs Duplex Reaction。
參考資料
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