數位 PCR 是一種端點 PCR 方法，用於絕對定量和在類似大多數序列的背景下分析少數序列 。g.,定量體變異。使用此技術時，樣本會被稀釋到極限，然後根據陽性反應和陰性反應的數目來確定目標濃度的精確測量。
數位 PCR (dPCR) 的概念是由 Sykes 等人於 1992 年1 構想出來的，然後由 Kalinina 等人於 1997 年2發展成奈米級的陣列格式。Vogelstein 和 Kinzler3 證明從結腸直腸癌患者提取的材料中可以檢測和量化罕見的 KRAS 基因突變，這是 dPCR 不斷改進的動力之一。Vogelstein 稀釋了患者樣本，使他們預期反應板上平均每 2 個孔中有 1 個模板分子。擴增突變位點周圍的目標序列，然後用兩個分子信標（參見定量 PCR 和數位 PCR 檢測方法）來檢測擴增子。第一個分子信標對於預期不會含有突變的區域具有特異性，此檢測作為 PCR 擴增陽性對照。第二個分子信標具有不同的染料標記，對野生型 (WT) 序列具有特異性。這樣一來，兩種標籤都顯示陽性信號的反應預期是 WT，而只顯示陽性對照的反應預期是突變。由於稀釋的結果，孔內的所有產物都會是均勻的，因此可以準確測量突變體與 WT 的比例。這些實驗提供了在標準 96 孔板中進行 dPCR 的範例，但其他人提出了更高通量的選擇，包括 Dressman 等人，他們提出了使用乳液珠進行 dPCR 的概念（現在用於 Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR、ddPCR™ 系統和 RainDance Technologies 的 RainDrop™ 儀器）。在另一種形式中，反應是在整合流體電路（晶片）上運行。這些晶片有整合的腔室和閥門，用來分隔樣品和反應試劑。
進行傳統 PCR 時，模板的最終濃度與起始拷貝數和擴增週期的數量成正比。在單一樣本上進行一定數量反應的一次實驗，其結果是片段大小的分析，或者，對於定量即時 PCR (qPCR)，分析是基於達到定量週期所需的週期數 (C< sub>q) 來估計反應中目標序列的濃度。sub>q); 請參閱 Quantitative PCR。使用 dPCR 時，樣本會稀釋並分離成大量的反應室，使每個分區都包含一個或不包含目標拷貝。反應室或分區的數量因系統而異，從使用 QX100 Bio-Rad 系統時的數千個到使用 RainDrop™ 方法時的數百萬個不等。然後在每個分區中進行 PCR，並使用螢光標籤檢測擴增子（請參閱 qPCR 和 dPCR 檢測方法），這樣收集到的數據就是一系列的陽性和陰性結果。理論上，這會導致原本含有單一目標拷貝的分區出現陽性信號，而原本不含模板的分區則出現陰性（即無信號）。
理論上，dPCR 可用於克服使用傳統 PCR 時所遇到的一些困難。使用 dPCR 時，樣本會被分割，因此樣本中的個別核酸分子會被定位到許多獨立的區域中，因此任何目標的檢測都不取決於擴增週期的數量。與 qPCR 相比，這種方法可以更靈敏地區分折數變化；優化的 qPCR 最多可以區分 1.5 倍的變化，而 dPCR 據報則可以區分 1.2 倍5。樣本的稀釋使其成為研究少數序列與大多數類似但不同序列之間差異的有用工具。例如，dPCR 可用於檢測低發生率的體內單核苷酸多態性 (SNP)，對比高濃度的 WT 序列。這是因為當樣本總量被稀釋時，稀有序列也被稀釋為單一拷貝，因此它會在沒有突出序列競爭的情況下被擴增。
數位 PCR 有許多潛在的應用，包括低階病原體、罕見遺傳序列、拷貝數變異 (CNV) 和單細胞中相對基因表達的檢測和量化。由單步 dPCR 實現的克隆擴增是降低許多「下一代測序」方法的時間和成本，從而實現個人基因組學的關鍵因素。
儀器
雖然 dPCR 是一種相對較新的技術，但許多平台已經被開發出來，努力提供更好的分析工具，例如；在不使用標準的情況下確定絕對定量、使用多重系統檢測罕見的基因突變，以及在診斷結果之間有把握地識別微小的折疊差異 (<1。5）。在不同的平台上，dPCR 的一般概念仍然相同：將輸入的 DNA 稀釋，以產生包含 1 或 0 份模板的奈米級或皮米級反應。在每個含有模板的液滴中進行個別的 qPCR 分析，而不是目標 DNA 的集合群3。除了提高罕見等位基因突變檢測和 CNV 測量的靈敏度外，還可以對陽性端點反應進行絕對量化，部分原因是 dPCR 測量不依賴標準曲線或樣本校正。可歸因於 dPCR 定量精確度提高的其他特點包括所產生的液滴具有可重複性和均勻性，以及所分析的分割反應數量增加6,7。
Fluidigm公司
首批商用dPCR儀器之一是BioMark™ HD dPCR系統（Fluidigm）。該平台基於微流控芯片技術。芯片有多種形式，包括 12 腔或 48 腔陣列。在 12 室陣列中，樣品被分成 765 個納升反應，每個晶片可產生 9,180 個反應。45 室陣列可將樣品分成 770 納升反應，每個晶片可產生 36,960 個反應。樣品被載入每個腔室的入口，然後納升級反應由壓力控制閥門和泵進行分割。樣品分割、混合以及熱循環反應均在晶片上進行。擴增之後，使用 BioMark 系統8擷取螢光影像。片上處理減少了手動操作，從而降低了引入錯誤的可能性，同時保持了更簡化、更易於使用的系統。
Fluidigm的dPCR系統允許每個樣品使用四個靶點進行多重反應。每輪熱循環前後都會拍攝芯片的螢光圖片。這樣就可以從最終的螢光圖像中減去任何熱循環前的背景，有助於準確計算陽性區域。該系統的另一個特點是能夠使用特定腔室的實時擴增圖來量化分佈到每個腔室的模板。如果 dPCR 並非實驗室中唯一的應用，BioMark™ HD 也可作為 qPCR 相容的儀器9,10,11。
Life Technologies
OpenArray® 和QuantStudio® 12K Flex dPCR系統（Life Technologies）採用微流體技術來產生和分析分區樣品。OpenArray 系統是最早開發的，最多可容納 3 個 dPCR 板。QuantStudio 12K Flex dPCR 儀器最多能容納 4 個 dPCR 板。每個 384 孔板有 48 個陣列。每個陣列內有 64 個「通孔」，因此每個板上有 3,072 個分隔的反應。納升反應使用自動分配系統分配到「通孔」中，並透過液滴與板上塗層之間的疏水和親水化作用穩定在那裡。此平台可用於每個樣品含有兩個目標的多重反應。
RainDance Technologies
RainDrop™儀器（RainDance Technologies）代表了另一種高靈敏度的 dPCR 平台。靈敏度和定量能力的提高可歸因於更小的皮升反應和分離液滴的數量；每個樣本約 1,000 萬個液滴。RainDrop dPCR 基於液滴乳化微流控技術。芯片可容納 8 個樣本，每個樣本可分割成 1,000 萬個反應，因此每個芯片可分割成 8,000 萬個反應。由於反應分區數量的增加，可以包含更多的輸入 DNA，使得此平台成為鑑定極其罕見突變的理想選擇。由於反應次數增加，使用此儀器可減少對輸入 DNA 稀釋的限制。此外，有報告指出，RainDrop™ 系統可用於量化每 200,000 個突變體中的 1 個，檢測下限為每 1,000,000 個突變體中的 1 個。這些觀察突顯了此儀器的靈敏度13。除了增強的靈敏度外，RainDrop™ 平台只需使用紅色和綠色標籤的螢光探針，就能複用每個樣品的 5 個目標。改變每個靶點的螢光探針用量可產生獨特的顏色強度，與突變特異性雙標籤探針（見 定量 PCR 和數位 PCR 檢測方法），且強度與檢測中使用的探針濃度直接相關。稀釋螢光探針以產生光碼的技術可能不只限於 5× 多重系統，也可能運用於產生 10× 多重系統，使其成為目前最強大的 dPCR 多重系統之一14,15。
雖然 RainDrop™ 是最具成本效益的平台之一，但它不能用於 qPCR 應用。此外，設置需要更多的人力，因此可能更容易引入錯誤。例如，液滴在微流控芯片中產生、收集，然後在芯片外進行熱循環測試。然後將反應物注入另一個晶片進行分析。多工樣本時，從一個晶片收集含有稀釋螢光探針的液滴，再注入另一個晶片，與含有引物、主混合物和 DNA 的液滴融合。
Bio-Rad
Bio-Rad的QX100™液滴數位™PCR技術是唯一在流程的任何階段都不使用微流控芯片的平台。取而代之的是，此儀器利用標準 96 孔板格式的油乳化技術。包含主混合物、引物、雙標示探針和 DNA 的八個樣品可同時載入一個盒中。每個樣品放置在含油的孔旁，使用真空液滴產生器一起進行液滴乳化。每個樣本可分成 20,000 個反應。液滴從 8 個樣品盒轉移到標準 96 孔板中。每個板可產生總共 1,920,000 個液滴，用於 dPCR 分析。
使用此平台產生的較多反應次數（每樣本 20,000 次/每板 190 萬次）增強了 dPCR 在確定絕對定量和 CNV 量測方面的
精確度。與其他每個樣品的分區反應數較少的系統相比，每個樣品的反應數增加後，可以載入更大量的模板 DNA。這在檢測罕見重要事件時變得越來越有價值。來自複製孔的數位讀取也可以結合起來，以確定罕見或低複製突變事件的 CNV。據報導，檢測下限可識別分區反應中 0.001% 的突變群。Bio-Rad 的 QX100™ Droplet Digital™ PCR 平台也被用於母體血漿 DNA，以確定母體和胎兒標誌物的絕對定量測量，突顯了 dPCR 技術在以低質量/低數量模板 DNA 測量 CNV 方面的優勢17,16。雖然 QX100™ Droplet Digital™ PCR 儀器每板可提供可觀數量的分割反應 (190 萬個)，而且價格合理，但它與 qPCR 應用不相容，每個樣本只能複用兩個目標。
儀器限制
數位 PCR 較 qPCR 有許多優點。這些優勢是透過將個別反應分割出來而實現的，從而豐富了低拷貝和罕見等位基因的擴增，同時由於微量反應數量的增加而增強了 dPCR 的精確度和定量能力。dPCR 不僅可用於測量絕對拷貝數、CNV 和稀有等位基因突變，還可用於量化低量/低質 DNA6,16,18,13,19,5,17。例如，在使用下一代測序時，使用 dPCR 定量有可能省去對輸入 DNA 進行滴定分析的需要和成本。
然而，在某些情况下，预扩增可能无法避免。在處理來自單細胞的 DNA 或輸入的 DNA 濃度已經很低時，可能需要在將樣本分成數千個反應之前進行全基因組擴增。值得注意的是，對目標 DNA 樣本進行預擴增可能會導致輸入 DNA 的擴增出現偏差，這有可能使 dPCR 結果出現偏差。因此，在評估絕對拷貝數9,11之前，可能有必要檢查此步驟所使用的方法是否會導致擴增偏差。此外，DNA 的結構已被證實會影響 dPCR 分析中的拷貝數測量。
dPCR的一個更明顯的缺點是設備的初始成本和對消耗材料的持續需求。與此相關的是，qPCR 儀器在實驗室環境中比較普遍，研究人員也比較容易操作這個平台。當然，使用者所期望的應用最終會為進行這些研究所需的儀器類型提供指引。
dPCR 應用
由於 dPCR 樣品會被分割到各個微反應器中，因此分割的數量決定了檢測靈敏度的範圍。與擴增週期不同，定量依賴於在終點計算陽性分區的數量，因此並不嚴重依賴擴增效率。為了考量目標 DNA 在分區中的隨機分佈，會應用 Poisson 統計模型1 並計算絕對量。目標序列的數量通常會與已知數量的參考序列比較來評估，以決定相對定量。目標 DNA 絕對和相對定量的應用包括測量 CNV、生物標記分析和罕見事件的檢測。此外，反轉錄可與 dPCR 結合來測量 RNA 分子。
CNVs是由於缺失、插入或重排造成的DNA異常拷貝，與疾病的易感性有關20,21,22。在癌症中，基因拷貝數通常會增加，病人對藥物治療的反應性與拷貝數有關23,24,25,26。許多方法已被用來量化 CNV，包括 SNP 陣列、下一代測序和 qPCR。最近，由於拷貝數測定的精確度較高，dPCR 已經成為量化患者生物標誌物的一種有吸引力的工具。數位 PCR 可用於精確判定 CNV，解析度可達 1.25。在 dPCR 中可以使用添加了 LNA 碱基的特定 qPCR 探针（参见 定量 PCR 和数字 PCR 检测方法）来区分和检测是否存在体细胞 SNP 变异（图 4.1）。探針的設計是突變特異性探針帶有螢光體 FAM，而第二個探針是野生型序列 (WT) 的特異性探針，帶有螢光體 HEX。WT 和 SNP DNA 目標在檢測中被區分。在某些情況下，基因拷貝可能「連結」在同一等位基因上，因此 CNV 可能會被低估9。串聯的基因重複可以用圍繞目標序列的特定限制性核酸酶消化模板 DNA 來解決16 (圖 4.2).
。
圖 4.1. 使用 Droplet Digital™ PCR 檢測和確定 SNP 變異的相對拷貝數。突變特異性探針帶有螢光染料 FAM，未修改（野生型）序列的探針帶有螢光劑 HEX。X 軸為 HEX 訊號，是野生型序列存在與否的函數。Y 軸為 FAM 訊號，是 SNP 變異序列存在與否的函數。在目標 DNA 中可以檢測到變異序列和野生型序列，並且可以直接確定每種序列的相對豐度。
圖 4.2. Droplet Digital™ PCR 方法確定 CNV。以純化、未消化的 DNA 為模板，量化相對於參考的基因拷貝數。同樣的 DNA 樣本也用圍繞目標序列的限制性內切酶進行消化，以闡明目標序列的連結拷貝。圖中顯示 Poisson 誤差條。
數位 PCR 用於量化存在於豐富 WT 序列背景中的變異 DNA 序列。例如，當臨床樣本中的正常基因型背景中存在特定於癌症的體變時，就可以檢測到體變。定量 PCR 只能偵測到 1% 或以上的突變序列。數位 PCR 提供了一種工具，由於將突變體目標 DNA 從 WT 中分割出來的稀釋效應，可靈敏檢測稀有拷貝。定量的動態範圍取決於存在的目標 DNA 量和評估的分割數目。現有的儀器在推薦的動態範圍方面各有不同。使用 Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR 系統可以從 100,000 倍的 WT16 中準確地檢測到罕見的突變 DNA，而使用 RainDrop™ 儀器則可以從 200,000 份的 WT13 中檢測到突變拷貝。用於罕見事件檢測的引物/探針組的典型評估包括將含 SNP 的模板 DNA 滴定到 WT 模板 DNA 中，每次稀釋都將含 SNP 的模板減少一半。圖 4.3 顯示了此類實驗的一個範例；當突變序列的頻率低至約 2,000 分之一時，單孔即可進行檢測，而相較之下，qPCR 的檢測限是 10 分之一。
由於可用於下一代測序的 DNA 樣本量通常有限，因此通常會透過 PCR 或全基因組擴大來擴大樣本。擴增後 DNA 分子的定量對於測序分析的效能至關重要，可使用分光光度法等方法進行。最近，dPCR 絕對 DNA 定量的能力已應用於下一代測序文庫的準備7。一種通用模板螢光探針 PCR 分析方法被開發出來，例如在一個 PCR 引物的末端設計一個探針特異性序列，用於文庫擴增27。
控制細胞活動（包括細胞分化）的基因的表達在細胞群中的個別成員之間存在差異，全群測量反映的是平均值28。雖然測量單細胞的轉錄可能比較可取，但存在的 RNA 量非常少，也就是 <1pg29。使用 qPCR 進行單細胞轉錄組分析的常規工作流程需要一個前置擴增步驟來擴增 cDNA。由於 dPCR 的動態範圍廣且能量化低濃度的範本，因此是一種不需使用前置擴增即可進行單細胞轉錄物分析的合適方法。
圖 4.3. 在 Droplet Digital™ PCR 分析和 qPCR 中用於罕見事件檢測的引物/探針組的評估。製備了帶有螢光染料 FAM 的突變特異性探針和帶有螢光劑 HEX 的未修改（野生型）序列探針。將含 SNP 的模板 DNA 滴定到野生型模板 DNA 中，以評估在豐富的野生型背景中是否能偵測到 SNP 變異。每次稀釋時，含 SNP 的模板減少一半。A) 引物/探针组用于突变滴定 DNA 模板的 qPCR。B) 引物/探針組用於突變試劑 DNA 的單孔液滴 dPCR。突變型與野生型拷貝的比率如圖所示。當突變序列的頻率低至約 2,000 分之一時，數位 PCR 可以進行檢測，而 qPCR 的檢測限是 1 到 10。dPCR 的檢測極限可透過聚合多個孔的資料以增加分區數目來進一步擴大。
參考資料
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