整個 PCR 工作流程很容易受到引入變異的因素的影響。許多可變成分是無法避免的，例如樣品的來源或反轉錄步驟的要求。化驗設計也是高度可變的因素，會造成 PCR 成功與失敗的差異，也會影響化驗的再現性與靈敏度。化驗設計的過程遵循邏輯流程：第一步是確定所需的目標位置。在某些情況下，寡聚體的序列是由應用所決定，無法避免，例如 SNP 檢測；在其他情況下，可以使用整個基因，例如拷貝數測定。一旦選定了近似的檢測位點，就可以確定最適合的引物，並決定修改。當要進行多重檢測時，必須考慮反應中所有寡聚物相互作用的可能性，以及目標物的相對豐度。在具有挑戰性的情況下，例如，當目標是檢測非常低的拷貝數或目標濃度的微小差異時，建議選擇和測試幾個引物組合，然後與合適的探針結合。第一種是 OligoArchitect Online，這是一種具有多種選項的軟體設計工具。如果設計需要專業能力，第二個選項是透過 OligoArchitect Consultative 要求設計，利用我們的專家分子生物學家的協助。
Amplicon Selection
擴增子是要分析的目標序列區域，由正向和反向 PCR 引物所包含。擴增子大小的決定部分取決於分析所用的方法。當透過凝膠電泳觀察 PCR 片段時，PCR 片段需要夠大，才能使用 DNA 結合染料有效染色，並符合所選人工尺寸標記的範圍。同樣地，當透過毛細管電泳儀器分辨片段時，PCR 产物的大小將介於 100 個碱基對至超過 2 kb 的任何地方（最終受酵素性能的限制）。
當使用 qPCR 進行最終讀取時，會選擇較小的擴增片段，以確保在每個週期進行精確的定量。理想情況下，qPCR 擴增片段的長度在 75 到 200 個基序之間，除非引物的設計限制超出了這個範圍。實際上，片段大小可考慮多種因素來決定，包括所考慮的生物學。
檢測位置可根據實驗的目的來預先確定：理想情況下，用於測定 mRNA 目標存在與否或數量的檢測會設置在外显子-外顯子交界處，以避免檢測到污染的 gDNA 序列。然而，這些區域通常是高度折疊的；因此需要做出務實的決定，是選擇性能可能較差的外顯子跨度檢測，還是選擇品質較高的外顯子檢測。如果 mRNA 豐富且轉錄自單一拷貝基因，則來自 gDNA 污染的信號貢獻將遠小於檢測來自多拷貝基因的低豐富轉錄本時的信號貢獻。
分析剪接變異需要特定於目標的設計方法。在某些情況下，同時檢測所有剪接變異是可取的，這只需選擇所有變異之間的保守外顯子邊界即可實現。然而，調查每個剪接變異的差異表達則需要更具創意的方法。在一個示例實驗中，目的是檢測 圖 6.1所示的替代轉錄本中哪些正在表達。由於外顯子相對較小，擴增所有外顯子會產生約 300 個碱基的結果，而擴增剪接變異則會產生較小的結果。這項研究的設計選項如下：
- 設計數個跨每個外顯子結合點的檢測，並用每個檢測探查每個樣本。
- 設計引物到第 1 外顯子的 3「 和第 4 外顯子的 5」。由任何外顯子組合組成的任何轉錄本的擴增都會產生特定長度的擴增片段。轉錄本的定義將使用 qPCR、反應後 SYBR Green I 染料熔融曲線來決定。
圖 6.1.以四個潛在剪接變體表示的基因示意圖。每種剪接變異可透過在每個外顯子結合點設計特定引物對，或從第 1 和第 4 外顯子的一般引物對進行擴增，並使用 qPCR、SYBR Green I 染料熔融分析來區分剪接變異。
一般而言，應使用下列標準評估擴增子序列：
- 建議對目標序列的區域進行初步評估。
- 確定沒有意外的 SNP。引物和模板之間的單個錯配可使熔解溫度降低 10 °C，影響 PCR 的效率。
- 確認所選序列與目標物種基因組/轉錄組中的任何其他序列沒有同源性。當以多種生物系統為目標時，例如
- 使用 OligoArchitect、所選設計軟體或 mfold (http://mfold.rna.albany.edu/)的折疊演算法測試目標序列採用次級結構的可能性，以在所需引物退火溫度下建立模板折疊模型。選擇具有預測開放結構的模板區域，避免具有非常負 ΔG 值的幹環次級結構。
- 避免回文序列和重複區域。
- 避免 G/C 豐富的區域，以 GC 含量約 50% 為目標。
- 設計多重檢測時，擴增子的長度和 CG 含量應盡可能相似，以避免擴增偏差。
- 對於特定於轉錄本的設計（避免檢測到 gDNA 模板），在可能的情況下，應以外显子-外顯子結合點上的區域為目標。
轉錄本特異性擴增子選擇
在 RNA 純化過程中，樣本中的 DNA 大都會被去除，但並非全部。為了避免 DNA 在 RT-qPCR 過程中被擴增，建議選擇在 mRNA 序列中沒有的大型內含子側邊或跨越外顯子-外顯子交界處的引物（圖 6.2）。
EnsemblGenomes網站（http://ensemblgenomes.org/）提供了許多脊椎動物、細菌、原生動物、真菌、植物和無脊椎動物 metazoan 物種的已知基因的內含子/外顯子註釋。另外，如果目標基因的基因組序列和 cDNA 序列都是公開的，則可以用 cDNA 序列與目標生物的基因組資料庫進行 BLAST 搜尋來確定內含子的位置（圖 6.3）。在 圖 6.3 中的內含子 1 很長（〜6.5 kb），在傳統的 qPCR 條件或受控的 PCR 條件下，DNA 不應該被擴增。然而，所有其他內含子都相對較短（<1 kb），因此 DNA 有可能在 RT-qPCR 期間被擴增（範例請參閱Assay Optimization and Validation）。引物應橫跨外子-外子結合點、側接長（數 kb）的內子或側接多個小內子。
圖 6.2.用於 RT-PCR 的(A)內含子跨接引物和(B)內含子側邊引物的說明。紅色為內子，綠色為外子。引物 P1 和 P2 跨接內含子，引物 P3 和 P4 側接內含子。請注意，除非退火溫度極低，否則引物 P1 和 P2 不會從 DNA 產生 PCR 產品。如果內含子短（約 1 kb），P3 和 P4 可能會從 DNA 產生較長的 PCR 結果，但如果內含子足夠長 （幾 kb），則不會。
圖 6.3.cDNA 序列與基因組 DNA 序列的 BLAST 比對。大鼠 p53 的完整 cDNA 序列來自 Genbank（登錄號碼 NM_030989），用於 megaBLAST 搜尋大鼠基因組中的相同序列 (blastn)。cDNA 與 10 號染色體上 gDNA 的比對結果如圖所示。利用此資訊，可將 cDNA 的外子與相對應的 gDNA 區域進行比對，並針對被長內含子分隔的外子進行引物設計，例如 1 號與 2 號外子。
甲基化特異性分析
<>DNA 甲基化是細胞分化的重要部分，會造成基因表達的穩定改變。/span>DNA甲基化是細胞分化的重要部分，會使基因表達以穩定的方式改變。甲基化對於高等生物的正常發育非常重要，而且可以遺傳。透過 DNA 甲基化進行基因調控，是指在胞嘧啶環的第 5 位或腺嘌呤環的第 6 位加入甲基。在成人體組織中，DNA 甲基化通常發生在 CpG 二核苷酸上下文中，而非 CpG 甲基化則普遍存在於胚胎幹細胞中。甲基化特異性檢測需要識別序列中的 CpG 島，通常是在基因啟動子區域內。使用 Beacon Designer (Premier Biosoft) 時，此資訊會自動定位，並可在 http://www.mybioinfo.info/index.php取得。
引物設計
引物的一般設計準則
對於大多數應用而言，引物的設計是要與其要引導的模板 DNA 序列完全互補。PCR 引物的基本設計考量包括：
- 引物的長度通常為 20-24 個核苷酸，熔解溫度 (Tm) 約為 60 °C
(59±2 °C) 用於 qPCR，但對於傳統 PCR 可能會有所不同 (55±5 °C)。特定的應用可能需要修改引物長度和 Tm。
- 引物對應具有 40-60% 的 GC 含量，並應缺乏明顯的次級結構。
- 引物不應與自身或夥伴引物互補，尤其是在 3' 端。
- 避免 3「 鉗位（檢查 3」 端 5 個碱基，接受其中 3 個為 A 或 T，2 個為 G 或 C）。
- 避免相同核苷酸長於 4 次重複或回文區域的運行。
SNP特異性引物
在某些情況下，例如在設計引物的時候，我們可以使用一些特異性引物。在某些情況下，例如設計單核苷酸多態性 (SNP) 檢測時，檢測的位置沒有彈性，周圍的序列也會影響所選寡聚體的序列。臨床狀況與種系及後天體質 SNP 之間的關係已被認可，這也持續推動著開發更靈敏、更特異的檢測系統。這反映出使用寡核苷酸雜交辨識 SNP 的挑戰性。這個挑戰是由於不同錯配之間的不穩定性差異所造成的。G:A、C:T 和 T:T 可能有很強的不穩定性，G:T 和 C:A 則弱得多，因為氫鍵可以形成，因此很難從天然的 G:C 和 T:A 中區分出這些配對。許多系統都是擴增-誘發突變系統 (ARMS)1 的改良版，該系統已被廣泛使用，並在篩選囊腫性纖維化突變中發揮了重要作用2。ARMS 引物長 30 個碱基（更長的引物，可達 60 個碱基）。位於 3' 處的碱基為 SNP 特異性，因此對於目標序列（正常或突變碱基）具有特異性。在倒數第二個位置會引入額外的錯配。這要考慮鄰近的碱基和 SNP 錯配來決定（表 6.1 改編自 Little, 2001）。
經Current Protocols in Human Genetics許可轉載。Little, S. 2001.Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of Point Mutations.Curr.Protoc.Hum.Genet.7:9.8.1-9.8.12.
其他研究小組也使用了類似的想法，並證明了在引物的 N-2 和 N-3 位置引入錯配的效用，Liu 等人3 對錯配的相對位置進行了深入分析，以獲得最大的失穩效果，從而獲得最高的特異性。
多重 PCR
當希望以每管更多的 PCR 來增加產量或節省樣品材料時，就需要在多重 PCR 中同時擴增幾個目標。引物設計是多重 PCR 成功的最關鍵因素。必須遵循一般準則，並驗證反應中所有引物（和探針）的相容性。在某些情況下，使用 Tm 約 65 °C、稍長的引物會有好處。如果要根據大小分辨分析所得的擴增子，則必須在檢測設計中考慮分析的解析力。當嘗試使用 qPCR 定量多個目標時，擴增子應儘可能相似，以避免擴增偏差。除了引物之外，模板不能採用穩定的次級結構也很重要，因為這會妨礙 PCR 的進行。如果已知目標物以明顯不同的濃度存在，則加入高濃度目標物的阻斷引物以利於準確檢測低濃度目標物4可能是有利的。
非編碼 RNA 定量
相較於編碼基因組，據估計約 97% 的人類轉錄組是由非編碼 RNA (ncRNA) 所組成5;6,7。這個家族的其中一個成員是長非編碼 RNA，它被描述為一類調控 RNA 分子。這些分子在表觀遺傳學、發育、癌症和重要的生物過程中扮演重要角色8,9。傳統上，長 ncRNA 的定義是由至少 200 個碱基的 RNA 鏈組成10,11,12。
相反地，組成 microRNA (miRNA) 的家族成員則帶來相當大的設計挑戰。這些是 21-23 nt 的短非編碼 RNA (sncRNA)，經由複雜的細胞通路在幾個轉錄本加工階段產生。MicroRNA 通過與轉錄本結合來負向調節蛋白質的轉譯（Kato 等人，200813中的評論），並誘導 RNA 誘導沉默複合物 (RISC)14 的形成。MystiCq® line 等商用檢測是解決 miRNA 所帶來的設計挑戰的可喜方案。有幾個建議的 qPCR 用於 miRNA 分析的方案15 對於那些研究沒有商業產品的生物，也有幾個出版物描述了潛在的解決方案。其中許多都是靠接合轉換器（Chapter 22, Casoldi, et al., in PCR Technologies; Current Innovations ed Nolan16）或使用多聚A聚合酶（polyA polymerase, PAP）17來增加原始miRNA的基序。在每種 miRNA 特異性引物中加入標記，可以優化雜交 Tm 而且已證明含有 DNA 引物的反應比添加鎖定核酸（Locked Nucleic Acid）18的反應更有效。
- 檢視 miRNA 序列，忽略 3「 處所有末端 A 碱基。 - 鑑定正向引物為從 5」 到 3' 末端 4 個碱基（忽略上述鑑定的 A 碱基）最長的一段序列。
- 前向引物 3「 處的 2 個碱基中最好有一個是 A 或 T。
- 3」 處的 3 個碱基最好包括 1 或 2 個 A 或 T。
- 3'處的 5 個碱基最好包含 2-3 個 A 或 T。
- 使用近鄰演算法分析前向引物的 Tm 。如果低於 59 °C，則按照給定的順序在 5' 處添加以下碱基，並計算每次添加後的 Tm ：G,A,C,G,C（得到 CGCAGN18 形式的引物，其中 N 是 miRNA 特定的碱基）。選擇 Tm 最接近 59 °C 的最短引物。如果高於 59 °C，則移除 5' 基序，並在每次移除基序後計算 Tm 。選擇 Tm 最接近 59 °C 的最長引物。
- 選擇反向引物的 3' 基序，確保這些基序與正向引物不是互補的。
- 在引物中加入 15×T (例如、5' T15 N5 3').
- 使用近鄰演算法分析正向引物的 Tm 。如果低於 59 °C，則按照給定的順序在引物的 5'處添加以下碱基，並計算每次添加後的 Tm ：G,A,C,C,T,G,G,A,C,C（得到 CAGGTCCAG T15 N5 N 是 miRNA 特定的基序）。選擇 Tm 最接近 59 °C 的最短引物。
- RT 引物為 CAGCTCCAG T15 V N（其中 V=A、C 和 G，N=A、C、G、T）。
引物設計範例
由於目標序列決定引物序列，因此不一定能達到預期的設計標準。因此，化驗設計的折衷方案可透過特定化驗的最佳化來克服。有些 PCR 目標可能需要特殊處理才能設計出成功的檢測方法。一個經常遇到的例子是病原體的檢測，包括病毒。眾所周知，許多病毒在其基因組的特定位置具有高度的變異性。乙型肝炎病毒就是一個很好的例子。在最近的一項研究中，為了針對已知的 HBV 變異株19設計成功的 qPCR 分析，必須對所有可用的 HBV 基因組序列進行廣泛的比對。我們使用 ClustalW 比對了數百個序列，試圖找出可用於一般檢測設計的重要共識序列。對比結果的片段顯示在 圖 6.4.中，星號（*）代表在分析所有基因組時發現的共識核苷酸（由於篇幅限制，沒有顯示對比中的大量其他序列）。
圖 6.4.HBV 基因組資料的部分 ClustalW 分析。所有已知的 HBV 基因組序列均使用 ClustalW 進行比對，並找出保留的核苷酸 (*)
在這種情況下設計引物和探針時，可能需要使用含有混合碱基（也稱為「搖擺」或退化碱基）的寡聚體。例如，考慮 HBV 的共識序列的細節（圖 6.5）。
圖 6.5.顯示共識區域的 HBV 對應選定區域
引物需要一個約二十三個碱基的區域。在這種情況下，當考慮到所有 HBV 基因組序列的所有可能性時，該二十三個碱基區域的實際序列如 圖 6.6所示：
圖 6.6.引物序列的排列，以容納所選共識引物區域的所有碱基選項。
模糊碱基的位置可以使用混合碱基的标准单字母代码来表示（表 6.3）。當這些應用於 圖 6.5 和 6.6 所示的序列時，寡核苷酸可以如 圖 6.7 所描述。
A = 腺苷，C = 胞苷，G = 鸟苷，T = 胸苷
。
圖 6.7.共識區域寡核苷酸的含糊不清的碱基以標準的單字母代碼表示。
此方案不太可能產生成功的 PCR 引物，因為需要處理與大量退化碱基有關的額外考量。尤其是，使用此序列製造的合成寡聚體，實際上會產生每個可能的單一碱基序列的混合物。可能的個別引物序列數量是透過乘以每個位置的個別碱基數計算出來的。對於此序列，這表示 1×2×1×1×2×1×2×1×3×2×1×2×1×2×1×2×1×2×1=6,144 個可能的單獨寡聚體。因此，反應中每種特定寡聚物的有效濃度會按比例減少。經驗分析顯示，引物中不同序列排列的數量不應該超過 512，因此這個例子不是最佳的退化基引物。重新設計不同的位置將提供一個潛在的解決方案。在 圖 6.8所示的例子中，引物包含 2 個可能錯配的基序。然而，這兩個碱基各有一個替代碱基，導致混合合成中有 4 個寡聚體，而且搖擺位於引物的 5' 區域。這些因素提供了比 圖 6.7中的引物高得多的成功機會。
圖 6.8.序列顯示配對共識基及潛在引物位置至共識區域。共識引物使用搖擺代碼顯示
在 PCR 中使用退化寡聚體時，可能需要修改擴增協議。可以在低退火溫度（35-45 °C）下循環 2-5 個週期。此外，從退火溫度到延伸溫度應採用緩慢的斜坡，大約需要 3-5 分鐘才能達到延伸溫度。然後應該在更嚴格的退火溫度下完成 25-40 個週期，且不進行斜坡修改。
可能的話，最好避免核苷酸異質性。特殊化寡核苷酸修飾，例如肌苷和其他「通用」基礎，例如 5-硝基吲哚，可能有助於減少複雜性和增加修飾基團，例如鎖定核酸（見引物修飾
探針設計
與 PCR 引物一樣，qPCR 探針的設計在很大程度上也取決於序列上下文和所需的應用。單一探針（如雙標記探針或分子信標）的長度通常為 20-30 個碱基。Scorpions® Probes 的探針長度較短，為 15-25 個基本位元。在 LightCycler 或 FRET 系統中，有兩個探針；感測器 (探針 1) 和錨 (探針 2) 探針位置很近，相隔 1-5 個基本位元。
- 使用雙標示探針時，Tm 應比引物高 7 °C至10 °C，以確保在引物雜交和延伸之前，探針已結合到目標物上。反應中的兩種 FRET 探針也是如此。用於 SNP 檢測時，感應探針（探針 1）位於錯配位點上方，避開探針的末端 3 個碱基，其 Tm (約 5 °C)比錨探針（探針 2）低。Scorpions® 探針是此建議的例外，因為探針是在延伸後而不是像其他探針系統一樣在延伸前與新合成的模板結合。
- 使用雙標示探針進行定量研究時，探針的位置應靠近正向引物的 3'，但不要重疊（約 5 個碱基）；檢測 SNP 時，請將雙標示探針或分子信標放在擴增子的中心，SNP 則放在探針的中心。
- 避免在探針的 5' 端，也就是報告器旁邊有一個胍，因為這會造成淬滅。
- 確保探針序列中 Gs 比 Cs 少。
- 避免運行相同的碱基（<4）和回文序列。
- 確保探針不能採用次級結構。
- 確保探針不能與引物雜交。
- 當設計多重反應的探針時，確保任何探針與引物之間沒有潛在的相互作用。
分子信標20。下面的例子顯示了在雙標籤探針上加入莖序列（紅色）以建立分子信標（圖 6.9 改編自 Thelwell 200021）。
圖 6.9.將雙標籤探針分析法適應於分子信標格式。牛津大學出版社核酸研究。經牛津大學出版社許可，透過版權清算中心以書籍/電子書的格式重複使用。
天蠍® 探針
Scorpions® 探針需要將探針與正向引物組合，使它們採用以下結構：5' dyestem-probe-stem-quencher-blocker-primer。引物和探針必須位於相反的鏈上，因為探針會與新建立的模板結合，而模板與引物位於相同的鏈上。圖 6.10 所示的範例顯示在雙標籤探針上加入標籤、淬火劑、PCR 阻斷劑和莖序列，以建立 Scorpions® 探針（改編自 Thelwell 200021）。
圖 6.10.將雙標籤探針分析法適應於 Scorpions® 探針格式。牛津大學出版社核酸研究。經牛津大學出版社許可，透過版權清算中心以書籍/電子書的格式重複使用。
探針的修飾
當探針位於具有不希望有的異質性的序列區域上時，模糊的碱基會如 PCR 引物所述被管理。同樣地，鎖定核酸也可以添加到探針中，原因與添加到引物中相同。
雙標籤探針、分子信標或 Scorpions® Probe 的 5' 用螢光體標記，通常是 6-FAM™。用於單次檢測或多路複用時，通常按 FAM、HEX™/JOE™、Cyanine 5 的順序選擇（確定標籤與儀器的兼容性至關重要）。雙標籤探針或分子信標的 3「 端以及 Scorpions® Probe 內部莖區域的 3」 端均使用淬火分子修飾。歷史上，染料 TAMRA 被用作 FAM 發射的受體，導致 FAM 淬滅。暗色淬火技術的發展使得 Black Hole Quenchers™ 得到廣泛採用，而我們最近推出的 Onyx Quencher™ 系列 (see 定量 PCR 和數位 PCR 檢測方法）。
模板对照
使用通常少于 150 个碱基的相对较短长度的扩增子的一个优点是，这样就有可能合成可用作合成扩增靶的长寡核苷酸。使用這樣的目標可能有助於開發和優化預期目標可能稀少或短缺的檢測，例如在抑制控制檢測 SPUD23 (see 附錄 A）或傳染病檢測研究19。
寡聚物合成和處理
訂購用於 PCR 應用的客製化寡聚體時，必須就所需的產量/合成規模、純度和所需的修改做出決定。這些因素會互相影響，例如表 6.4、6.5 和 6.6 就我們製造的寡核苷酸的合成規模和預期產量提供了指引。
寡核苷酸純化
合成 DNA 時，每個核苷酸都會從序列的 3' 端開始，依序耦合到成長中的鏈上。在每個耦合週期中，有一小部分的寡核苷酸鏈不會延伸，因此會產生全長產品和截短序列的混合物。寡核苷酸從支持物上裂解並移除保護基團之後，就可以使用純化來分離全長的產品和截短的序列。一般而言，特定應用所需的純度取決於截短寡聚體可能造成的影響。對於某些應用而言，只有全長 (n) 寡聚物是至關重要的。對於其他應用，例如 PCR 引物，較短的寡聚體 (n-1,n-2,...) 的存在可能不會影響實驗結果。
脫鹽純化
脫鹽程序可以去除合成、裂解和脫保護步驟中殘留的副產品。
對於包括 PCR 在內的許多應用，脫鹽純化對於長度不超過 35 個碱基的寡聚體是可以接受的，因為全長寡聚體的絕大多數會超過較短產品的貢獻。克隆所需的寡聚體或長度超過 35 個基本位元的寡聚體則需要額外的純化方法，例如反相濾盒純化 (RP1)、HPLC 或 PAGE（視長度而定）。
反相濾盒純化（RP1）
在反相濾盒上進行分離可去除高比例的截短序列。全長產品和截短序列之間的疏水性差異是分離的基礎。全長的寡核苷酸會保留在色譜柱上，而截短的序列則會被洗掉。
反相 HPLC
隨著寡核苷酸長度的增加，截短序列的比例也趨於增加。RP1 並不能去除所有這些雜質，因此對於較長的寡聚體，例如人工擴增子模板寡聚體或標籤探針寡聚體，建議使用 HPLC 或 PAGE 純化。反相高效液相層析 (RP-HPLC) 的操作原理與反相柱相同。然而，更高的解析度可達到更高的純度。HPLC 是一種高效率的純化方法，適用於含螢光團的寡聚體，例如 qPCR 探針，因為其固有的親油性可提供極佳的產品與雜質分離效果。此外，由於色譜柱的容量和解析特性，RP-HPLC 是較大規模實驗的首選方法。基於親脂性的解析度會隨著寡聚物長度的增加而降低。因此，通常不建議使用 RP-HPLC 來純化長於 50 個碱基的產品。
阴离子交换 HPLC
阴离子交换分离是基于分子中磷酸基团的数量。陰離子交換純化方法是在季銨鹽固定相柱或類似結構上使用鹽梯度洗脫。其解析度極佳，適合較少量的純化。此技術可搭配 RP-HPLC 純化，為分離過程增加第二層次。負離子交換 HPLC 受限於寡核苷酸的長度（通常最多 40mers）。寡核苷酸越長，負離子交換式 HPLC 色譜柱的解析度就越低，因此目標寡核苷酸的純度也就越低。
聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)
聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE) 分離的基礎是電荷多於分子量，因此有很好的尺寸解析度，使全長產品的純度達到 95-99% 的水準。由於從凝膠中萃取寡核苷酸所需的程序複雜，且需去除絕大多數的截短產品，因此 PAGE 的產量較其他方法低。當需要高度純化的產品時，建議使用此技術。對於較長的寡核苷酸 (≥50個碱基)，建議使用 PAGE 來純化。
*保證為 20mers 或更長。較短的寡聚體可能有較少的 OD。
*保證為 20mers 或更長。
註: 合成後修飾的結果可能比上述數值少 50%。
所有探針都經由 RP-HPLC 純化。
寡核苷酸的製備
乾式提供的 DNA 寡核苷酸在重新懸浮後即可使用。建議將寡核苷酸重懸於弱緩衝液中，例如 TE (10 mM Tris, pH 7.5-8.0, 1 mM EDTA)。在不適合使用 TE 的應用中，可使用無菌的無核酸水。然而，高級水可能略呈酸性，不建議用於長期儲存寡核苷酸。
100 μM 的儲備溶液可根據以下指引獲得：取所提供的納摩爾 (nmol) 數（可在隨寡核苷酸提供的試管標籤和/或質量保證文件上找到的資訊）乘以 10。得出的結果是要達到 100 μM 的最終濃度，需要添加到試管中的液體微升數。例如，如果寡核苷酸的產量是 43.5 nmol，則 100 μM 儲備液的添加量為 435 μL。請注意，這相當於 100 pmol/μL 的庫存溶液。然後，可根據應用需求，視需要進一步稀釋原液。PCR 通常使用 10 μM 或 20 μM 的工作濃度。以等分的方式將試劑溶液儲存於 -20 °C，並避免多次冷凍-解凍循環。
參考資料
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