菌落 PCR

集落 PCR 是驗證克隆 DNA 結構體組裝是否正確的一種簡單快速的方法。傳統上，在克隆過程中驗證 DNA 的插入是非常耗時的，需要在細菌轉換後進行費力的 DNA 純化和隨後的限制性酵素消化。Colony PCR 是一種直接 PCR 方法，它繞過了 DNA 分離和限制性酵解，為篩選克隆建構物提供了快速、簡便且廉價的解決方案。集落 PCR 應用也相容於篩選序列和限制性獨立方法所建立的克隆。

• 使用 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 試劑時，生長媒體對 PCR 產量的影響
• 集落 PCR 及相關 PCR 產品

REDEmp™ PCR ReadyMix™ 和 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ olony PCR ACat.R4775）和 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™（Cat.No.P0982）均以單一 2x 溶液的形式提供緩衝液、聚合酶、dNTPs 和穩定劑。它們的配方可讓您直接進行 PCR，然後在 PCR 之後將樣品載入瓊脂質凝膠，而不需要額外的緩衝液或載入染料。惰性染料的遷移速度與 125 個碱基配对片段的遷移速度相同，可提供 DNA 遷移的視覺確認。

特徵與優點

• 絕佳彈性：擴增前無需純化 DNA。適用於常見的大腸桿菌菌株，例如 SIG10 5a、NovaBlue (K-12)、BL21(DE3) 和 DH5α 菌株，以及S. pombe酵母。樣本也可以再擴增，例如在巢式 PCR 中。
• 高特異性& 產量：JumpStart™  Taq DNA 聚合酶是一種抗體失活的熱啟動酶，其設計旨在減少非特異性擴增，同時提高目標產率和特異性。JumpStart^™ Taq 最多可擴增 7 kb 長的目標：JumpStart™  產品的熱啟動功能允許在室溫下進行反應設定，這對處理多個樣本非常有利。REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ 和 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 在 4 °C 或 -20 °C 下穩定：JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 已證明可耐受高達 20% 的 LB 濃度和高達 10% 的 LB Agar 或 Terrific Broth：降低因多次移液步驟造成污染的風險，並在多個反應中提供一致的性能：無需添加載入緩衝液或追蹤染料。PCR 產品在擴增後直接載入瓊脂質凝膠中。紅色示踪劑的遷移速度與 125bp 片段的遷移速度大致相同（略快於溴酚藍）。

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C協議

菌落 PCR 協議簡單直接：只需從平板或高密度細菌液體培養物中加入少量菌落到 PCR 主混合物中，然後進行熱循環測試。在最初的高溫培養過程中會發生細胞裂解。所得的 PCR 產品可用凝膠電泳或其他 DNA 檢測方法進行分析。

1. 準備 PCR 主混合物（根據要分析的樣本數量調整）：

2.

容量 (每個反應)
REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™或 JumpStart™ REDTaq® PCR ReadyMix™	10 µL <
Forward Primer (20 µM)	0.5 µL
Reverse Primer (20 µM)	0.5 µL
0.	9 µL
20 µL

2.將PCR混合母液（20 µL）分配到每個PCR管或平板中。使用無菌微吸頭或無菌牙簽，將細胞從每個菌落轉移到 PCR 管中，並短暫攪拌使其重悬於 PCR 母液混合物中。混合物可能看起來有點混濁。注意：不要挑取太多細胞。過多的細胞會干擾 PCR。用以下熱循環條件擴增目標 DNA：

5.

Step	Temperature	循環 週期
	94 °C	1<
1	94 °C	0.5 分鐘	30-40
退火	0.5 分鐘
72 °C	1-2 分鐘 (~ 1 kb/min)
4 °C	無限期

注意：細胞裂解步驟比一般的初始變性更長，以有效地破壞細菌壁

。

5.        PCR 完成後，將每個反應的 5 至 10 µl 直接載入 1% 琼脂糖凝膠中，預留一條通道放置適當的梯子，並進行電泳。

C東

使用代表性的細菌和酵母菌株進行菌落 PCR。E. coli competent cells SIG10 5a (Cat. No. CMC0001), NovaBlue (Cat. No. 69825), BL21(DE3) (Cat. No. 69450), and DH5α (Thermo Fisher Scientific) were transformed with pET28a(+) containing an inserted sequence.SIG10 5a也用空的pET28a(+)載體進行轉換。使用REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™和擴大插入序列1 kbp的側邊引物篩選大腸桿菌菌株。所有大腸桿菌菌株都與菌落 PCR 相容，無需 DNA 提取步驟即可直接從粗細胞輸入產生目標擴增子（圖 1）。

圖一 大腸桿菌菌落 PCR 产物的琼脂糖凝膠。 使用 REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ 進行 1 kbp 插入物的菌落 PCR，並在 1% 琼脂糖凝膠上進行分析。所有含有插入物的 pET28a(+) 的轉化細胞（樣本 3-10）都檢測到了產品，而用 pET28a(+) 空載體轉化的細胞（樣本 1-2）則沒有擴增產品。

Schizosaccharomyces pombe酵母用 pESP-1 進行轉換。對得到的菌落和質粒對照進行 PCR。使用 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 和可擴增 226 bp 插入物的側邊引物篩選酵母菌落。 像大腸桿菌一樣，目標序列從酵母樣本中擴增，無需DNA純化（圖2）。

圖二 S.pombe集落PCR產物的琼脂糖凝膠。 使用 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 進行 226 bp 插入物的菌落 PCR，並在 1% 琼脂糖凝膠上進行分析。 所有轉化細胞（菌落 1-3）和質粒模板（對照組）均檢測到產品。

Effect rowth M上 PCR Y興 JumpStart。™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ Reagents

為了量化生長媒體污染對 PCR 的影響，常見的 E.在 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 試劑中添加了大腸桿菌培養基 LB、LB Agar 和 Terrific Broth (TB)。以 pBR322 為模板，使用適當的引物、α [32P] dCTP 及不同濃度 (0 - 50%) 的 LB、LB Agar 及 TB 進行擴增。在玻璃過濾器上進行三氯乙酸沉澱後，再進行閃爍計數，以確定 PCR 產率。產率以 0% 添加的培養基為標準。反應一式三份。所有的培養基添加量都會影響產物產率，但使用 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 進行 PCR 時，如果 20% 的反應混合物由 LB 組成，10% 的反應混合物由 TB 或 LB 瓊脂組成（圖 3），則 PCR 仍然很穩定。這些水平超出了典型菌落 PCR 的污染程度，證明 JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 試劑具有很高的抑制劑耐受性。

圖三 在 PCR ReadyMix™ 試劑中添加 LB、LB 瓊脂和 TB 的效果。LB，粉紅色方塊；LB 瓊脂，藍色菱形；TB，綠色三角形。

ColonyPCR P效能umpStart^TM and REDTaq^® ReadyMix^™ Reagents

REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™、JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™，以及其他JumpStart™ 和 REDTaq^® ReadyMix^™ 產品，例如 R2523 和 P1107 是強大的混合母液，可直接對常見克隆和表達菌株的菌落和培養物進行 PCR，包括 大腸桿菌和大腸桿菌。coli和S. pombe，有助於快速篩選克隆建構物。它們對常見的 PCR 抑制劑有很高的耐受性，包括最高 20% 的 LB 濃度和最高 10% 的 LB Agar 或 Terrific Broth，因此在集落 PCR 中具有很高的性能。混合母液可克服細胞碎片的影響，可直接用於粗菌落或懸浮液，擴增長度達 7kb 的目標。其他超快速 PCR 主混合物，包括我們的 KOD One^™ PCR 主混合物，也適用於集落 PCR 應用。如需其他 PCR 試劑與資源，請瀏覽我們的 PCR 試劑與套件資源中心。

材料

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