基因組 DNA 的純化與評估
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DNA和RNA純化的簡單方法的出現，大大促進了基因組和基因表達的分析和表徵。從各種細胞來源（包括哺乳類動物、植物和細菌培養物的細胞和組織）快速方便地分離 DNA 和 RNA 是一種需求。傳統的 DNA 分離與純化方法是以多步驟程序為基礎，涉及苯酚/氯仿、負離子交換或矽膠交換系統。
PCR或RT反應中模板材料的品質對所得數據的可靠性有深遠的影響1。確定和報告目標材料的品質非常重要2 最好盡可能使用最高品質的核酸。本章深入分析了目標物質對結果 qPCR 和 RT-qPCR 資料的影響，並考慮到純度和完整性。
核酸純化
核酸純化是大部分分子生物學實驗的首要條件。DNA 和 RNA 樣本通常透過「粗製」的方式取得。這些純化方法既快速又直接，尤其適用於只需要少量 DNA 或 RNA 的 PCR/RT-PCR 樣本。有些應用需要透過傳統方法純化的樣品；最終的應用將決定選擇哪種方法最好。當生物材料中的核酸需要完整、純淨、濃縮且沒有下游酵素反應的抑制劑時，萃取程序就需要加入混沌營養劑。
促混沌劑
促混沌劑是一種通過破壞分子的三維結構使蛋白質、DNA 或 RNA 變性的物質。促混沌劑會干擾分子內由氫鍵、范德華爾斯力和疏水效應等非共價力所介導的穩定互動。常用的混沌劑包括尿素 (6-8M)、硫氰酸胍 (6M) 和高氯酸鋰 (4.5M)。硫氰酸胍是一種強效的蛋白質變性劑，比鹽酸胍更強，常用於完整核糖核酸的分離過程中，以消除 RNase 的活性。許多 RNA 分離方案除了混沌劑之外，還加入巯基乙醇，以提供還原環境，使核糖核酸酶 A (RNase A) 八個半胱氨酸殘基間形成的四個二硫橋變性。混沌劑與還原劑（如巯基乙醇）的結合會使核糖核酸酶展開並徹底失去活性。
基因組 DNA 的萃取
粗製品
Extract-N-Amp?試劑盒可用於從幾乎任何類型的樣本中快速、有效地提取 PCR 準備好的基因組 DNA (gDNA)，使用簡單的單管方案，根據樣本的不同，只需 15 分鐘或更短的時間。Extract-N-Amp Kits 已被用來從全血、毛囊、小鼠尾巴剪、組織培養細胞、口腔拭子細胞、黑腹果蝇、各種植物和種子等樣本中萃取 gDNA。與完整的純化程序不同，此方法避免了機械破壞、有機萃取、柱純化或 DNA 的沉澱。試劑盒中含有提取和擴增 DNA 的試劑，這些試劑可用於許多下游應用，包括 PCR/qPCR 分析。
基因組 DNA 的純化
DNA幾乎可以從任何細胞或組織來源中分離出來。純化 gDNA 需要將其從細胞中移除，同時防止降解。分離程序也必須夠溫和，以保護長的 DNA 鏈不受機械壓力的影響。樣本首先在緩衝液（如磷酸緩衝生理鹽水 (PBS)）中採集，通常含有去垢劑（如 Triton™ X-100 或十二烷基硫酸鈉 (SDS)）以裂解細胞並溶出蛋白質和脂質。加入蛋白酶 K 以分離團塊狀的細胞和組織，並透過蛋白分解使酵素失活。乙二胺四乙酸 (EDTA) 是一種螯合劑，可作為溶液中金屬離子的清除劑，加入 DNA 純化緩衝液中可去除鎂離子 (Mg2+)。Mg2+ 是DN酶的重要輔助因子，因此去除Mg2+ 可使DN酶失活，防止DNA降解。
在裂解細胞並降解 RNA、蛋白質和脂質之後，DNA 必須從這些物質的剩餘殘渣中分離出來。經典的純化方法是使用苯酚/氯仿3 來去除蛋白質，留下DNA和其他水溶性物質。TRI Reagent® 使用此方法的改良版。另一種方法是使用 GenElute™ gDNA 純化套件等系統，在會破壞蛋白質結構的混沌鹽存在下，將 DNA 吸附到矽基膜（單柱和 96 孔格式）上。從植物材料中純化 DNA 時，組織必須先在液氮中研磨，以機械方式破壞，而全血或細菌則需預先與酵素培養，以確保有效的細胞裂解及 DNA 釋放。DNA 在與膜結合在一起時會被洗滌，然後透過改變鹽的濃度來洗脫，之後再用洗滌劑和混沌劑來釋放。蛋白質、多醣體和細胞碎片會經由沉澱程序去除，然後再經由過濾柱離心。
總 RNA 的純化
研究基因表達或其他受 RNA 調控的細胞功能時，需要純化細胞 RNA。總 RNA 是指從細胞 DNA（gDNA 和線粒體 DNA，mtDNA）轉錄出來的 RNA，一般是指含有以下資料的樣本：核糖體、轉移和信使 RNA（rRNA、tRNA 和 mRNA），不包括 microRNA (miRNA) 或更小的非編碼 RNA (ncRNA)。
RNA的分離具有挑戰性，因為細胞和組織中無處不在的核糖核酸酶（RNase）會快速降解RNA。因此，在純化過程中會加入 RNase 抑制劑。最常見的純化方法是硫氰酸胍/氯仿萃取。這是 TRI Reagent® 的原理，它是一種含有苯酚和硫氰酸胍的單相溶液。組織或細胞樣本在 TRI 試劑中均質或攪拌，氯仿與裂解液混合，然後離心將混合物分為三相。移除含有 RNA 的水相，再使用異丙醇沉澱 RNA。GenElute RNA 分離試劑盒可在細胞裂解後，將 RNA 擷取至矽樹脂上。GenElute 套裝在分離總核與細胞質 RNA 時，會使用硫氰酸胍與 2- 巯基乙醇來使 RNase 失活。在有硫氰酸胍存在的情況下，蛋白質容易溶解，細胞結構瓦解，核蛋白會因蛋白質次級結構消失而與核酸解離。此外，由於硫氰酸胍比 HCL 胍更有效，RNase 會永久變性。裂解液經過濾柱旋轉，以去除細胞碎片和剪切 DNA。
在總 RNA 樣本中，大部分是 rRNA（約 80%），而 mRNA 部分只有 2-5%。
在總 RNA 樣本中，大部分是 rRNA（約 80%），而 mRNA 部分只有 2-5%。對於某些程序，可能需要從含量較高的 rRNA 和 tRNA 中純化 mRNA。GenElute mRNA 套件提供方便的程序，可從先前製備的總 RNA 或直接從哺乳動物細胞和組織中分離多聚腺苷酸化的 mRNA。對於直接製備 mRNA，細胞或組織會被 SDS/ 蛋白酶 K 消化破壞，以釋放 RNA 並消除 RNases。Oligo dT30 covalently linked to 1 μm polystyrene beads is then used to capture polyadenylated mRNA by hybridization.聚苯乙烯珠在雜交期間保持懸浮狀態，不需要混合或搖動。
許多用於純化「total RNA」的萃取方法專門選擇較大的分子，因此不適合分離較小的 ncRNA，包括 miRNA。
小RNA (miRNA)和非編碼RNA (ncRNA)的純化
由於miRNA和其他較小的ncRNA分子長度較短，其純化更具挑戰性。重要的是要選擇適當的 RNA 分離方法，以保留小 RNA，並避免使用總 RNA 純化試劑盒，除非製造商特別說明總 RNA 包括小 RNA <100base。ncRNA 的萃取方法針對 RNA 分子與任何其他污染因子之間的差異，使用特定的柱子結合或沉澱。RNAzol® 是一種酸性硫氰酸胍-苯酚混合物，可破壞細胞和組織，並加入氯仿或溴氯丙烷，將所有 RNA 物種與蛋白質和 DNA 分離。純化方法可分別製備小 RNA、mRNA 或總 RNA 樣本，以便在下游應用中平行分析這些分離物。miRPremier® microRNA Isolation 試劑盒是專為小 RNA 回收而設計的矽基洗滌齧合試劑盒。miRPremier 試劑盒在將小 RNA 與色譜柱結合前，會先使用鹽析法去除較大的分子，因為將小 RNA 與矽石（二氧化矽）結合所需的乙醇量也會沉澱蛋白質和其他大分子，形成黏稠的懸浮液體，可能會堵塞色譜柱，無法有效回收 RNA。規避這個問題的另一種方法是使用預先清除步驟來去除大分子，例如使用 RNAzol 或預先結合柱來萃取，如此一來就可以加入足夠的酒精來結合小 RNA，而不會堵塞 RNA 結合柱。
核酸樣品品質評估
樣本處理和核酸萃取程序是多變的，因此定義一個可靠的方案來分析樣本的質量和數量，並在出版物2中包含此分析的細節是至關重要的。RNA 的數量主要取決於 rRNA 的產量，而 RNA 的品質則取決於純度 (沒有抑制劑) 和 RNA 分子的完整性。然而，在測量樣本的品質時，純度和完整性會影響結果；很難確定低濃度樣本的純度和完整性，而且雜質的存在會干擾定量。有許多技術可以用來評估核酸的數量和品質，但沒有任何一種技術可以單獨提供完整描述樣本所需的所有資訊。
核酸定量
紫外分光光度法
核酸的定量傳統上是使用分光光度計測量紫外吸收。DNA 或 RNA 稀釋樣品的吸光度在 260 nm 和 280 nm 處讀取。260 nm 處的光密度 (OD) 是利用 Beer-Lambert 定律來判定溶液中的 RNA 或 DNA 濃度，Beer-Lambert 定律預測吸光度與濃度之間呈線性關係。
比爾-朗伯定律
A = εbc
A = 吸光度
b = 比色皿的路徑長度，單位 cm（通常為 1 cm）
c = 分析物濃度
ε = 消光係數
對於 RNA，ε = 40 μg/mL
對於 DNA，ε = 50 μg/mL
在 260 nm (A260) 的 OD 讀數為 1.0 約相當於 40 μg/mL 純 RNA 和 50 μg/mL 純雙鏈 DNA。然而，Beer-Lambert 定律僅適用於最高為 2 的 OD 讀數，且所述的 OD/濃度關係依賴於樣品的純度。顯然，在 260 nm 或 280 nm 有吸收的污染物質會影響估計的 OD 讀數。純 RNA 的 A260/A280 為 2.1，而純 DNA 的 A260/A280 為 1.8。
如果分別在 280 nm 和 230 nm（A280 和 A230, ）處測量樣品的吸光度，則還可以測定蛋白質、混沌鹽和苯酚等潛在污染物質的 OD。如此一來，A260/A280 和 A260/A230 的比值可作為樣品純度的指標。
此外，pH 值和緩衝液的離子強度也會干擾 OD 讀數。研究顯示，當使用不同來源的水來進行分光光度測定時，A260/A280 比率會有顯著的變異。例如，用於懸浮 RNA 的水的 pH 值在 pH 5.4 到 7.5-8.5 之間的變化會顯著增加 RNA A260/A280 比率，從大約 1.5 到 2.05。
重要的是，A260/A280 比率和 A260/A230 比率都接近 2.0（表 7.1）。
TRIS、乙醇及異丙醇污染
TRIS污染的影響: TRIS污染對RNA/DNA的吸光光譜影響不大。
乙醇污染的影響: 乙醇在TE pH 8.0中測量時，對RNA/ DNA的吸光光譜影響不大。然而，在純水中測量時，A260/A280 比率可能會降低，因此比率低於 2.0 可能表示有乙醇污染。
異丙醇污染的影響： 在 TE pH 8.0 中測量時，異丙醇對 RNA/DNA 的吸光光譜沒有顯著影響。但是，在純水中測量時，A260/A280 比率會降低，因此比率低於 2.0 可能表示受到異丙醇污染。
蛋白質、異硫氰酸胍和酚污染
蛋白質污染的影響： 一個含有0.01% 的 BSA 可以顯示幾乎正常的吸光光譜，不過 A260/A280 比率可能會低於 1.9 (RNA) 或 1.7 (DNA)，這是一個警告，表示有東西污染了樣品。在 0.5% BSA 時，吸光光譜會出現異常，這清楚顯示樣品中有相當程度的污染。因此，高濃度的蛋白質可能會透過異常的 A260/A280 ratios 檢測出來，但低濃度和中等濃度的蛋白質則不會。
異硫氰酸胍污染的影響： 異硫氰酸胍對 A260/A280 比值影響不大，因此異硫氰酸胍對 RNA 的定量影響較小。然而，異硫氰酸胍的存在對 A260/A230 比值有非常大的影響；在 0.5% 的污染下，A260/A230 比值會降至 0.5 以下。
苯酚污染的影響: 苯酚對 RNA 的定量有非常大的影響。當 50 ng/μL 的 RNA 樣本受到 0.5% 的苯酚污染時，測得的濃度會高出三倍以上。苯酚對 RNA 定量的這種強烈干擾作用是由於 270 nm 處的污染吸收峰所致。在 RNA 濃度非常低（低於 10 ng/μL）時，此污染峰常被混淆為 RNA。然而，RNA 的吸光度總是在 260 nm，而非 270 nm，因此如果峰值在 270 nm，則是由於污染所致。使用基於苯酚的方法分離 RNA 後，錯誤高估 RNA 濃度是一個嚴重的問題。尤其是在 RNA 濃度較低的情況下。
自動化 UV 分光光度法
傳統的 UV 分光光度法需要使用相對較大量的樣品來進行量測，但現在有了一些系統，例如 NanoDrop®&span...sup>® 2000 UV-Vis 分光光度計等自動化系統，可支援極小樣本量的高度精確分析。樣品保留系統省去了比色皿和毛細管，使分析的樣品量降低到 0.5 μL 到 2 μL。NanoDrop 可提供從約 200 nm 到 350 nm 的吸光度掃描，這是判定 RNA/DNA 濃度和純度的相關區域。
以螢光為基礎的核酸定量系統
使用螢光染料來定量核酸是吸光分光光度法的替代方法6,7。使用螢光方法來測定核酸濃度，是利用小分子或染料與核酸結合，然後測量隨後的螢光特性變化。
由於螢光儀是以相對單位而非絕對單位量測螢光，因此量測時首先要用已知濃度的標準核酸溶液進行校準，該溶液的特性與待測樣品相似。校準之後，單次測量即可確定溶液中的核酸濃度，但通常需要標準曲線來確定測量範圍內的檢測線性度。
自動化系統（例如 QuBit® 2.0 螢光儀 (Life Technologies)）可與一系列不同的螢光定量分析法搭配使用，以測量溶液中的核酸濃度。
關鍵是要注意，OD 讀數是吸收的量度，不能作為樣品品質的完整評估。同樣地，基於螢光的系統提供的是數量而非品質的測量。舉例來說，這些系統不能用來檢測樣本的完整性，還必須進行適當的分析，例如毛細管電泳、凝膠解析或 3'/5' 比率檢測（如下所述）。
凝膠電泳和毛細管核酸品質分析系統
。凝膠電泳
RNA 雖然在熱力學上是穩定的，但在幾乎無所不在的 RNase 酵素的作用下會被快速消化。因此，樣品中通常會出現較短的 RNA 片段，這可能會影響下游應用的結果。RNA 的降解過程只有部分瞭解，而且取決於存在的 RNase 種類。此外，特定萃取物的 RNA 品質可能差異很大，需要持續監控。
為了評估潛在的降解，電泳方法已被應用於根據所包含分子的大小來分離樣品。從歷史上來看，RNA 的完整性是使用瓊脂糖凝膠電泳來評估的，瓊脂糖凝膠電泳會用溴化乙锭染色，產生明確的帶狀圖案。在變性瓊脂糖凝膠上運行的總 RNA 會顯示兩個不同的核糖體片段，對應於真核 RNA 的 18S 或 28S，或原核 RNA 的 16S 和 23S，以及更小的 RNA 物種的其他片段。傳統上，變性瓊脂糖凝膠上這些 rRNA 頻帶的強度被用來計算一個比率，作為 RNA 完整性的指標。當真核 28S:18S 頻帶強度的比率約為 2.0 時，RNA 被認為是高品質的。
圖 1 顯示了用溴化乙锭染色的瓊脂質凝膠電泳來評估總 RNA 的例子。對於
優質的總 RNA，兩個最大的 rRNA 會在約 5 kb 和 2 kb 處呈現分離的條帶，上方條帶的強度應約為下方條帶的兩倍。mRNA 可能呈現淡淡的污點，或幾乎不顯著，大多在兩條 rRNA 帶之間。
圖 1.以瓊脂糖凝膠分析評估 RNA 的完整性。總 RNA 樣本（2 μg）在 TBE 緩衝液中的 1% 瓊脂質凝膠上分離，並用溴化乙锭染色。第 1 和第 2 行顯示高品質的 RNA，而第 3 和第 4 行顯示降解的 RNA。
然而，凝膠電泳是一種不靈敏的方法，無法判定樣品的完整性，而且需要高濃度的樣品。當處理小量樣品時，很少有足夠的樣品進行凝膠電泳並執行所有所需的實驗。
總 RNA 的自動毛細管電泳分析解決了其中一些問題。
毛細管核酸品質分析系統
核酸樣品可使用 Agilent 2100 BioAnalyzer 或 Bio-Rad Experion 等儀器進行分析與比較。
這些儀器使用晶片上實驗室的方式，結合毛細管電泳與螢光偵測。芯片上進行的電泳過程是基於傳統的凝膠電泳原理，並將其微型化，從而減少了樣品消耗和分離時間。
芯片可容納放樣品、凝膠和外部標準（片段大小階梯）的孔。在製造過程中，微通道是在玻璃中製造的，以便在孔中形成互聯網。然後在這些微通道中填充篩分聚合物和螢光染料。
在電壓梯度的作用下，帶電的生物分子（如 DNA 或 RNA）會驅動通過矩陣。
染料分子夾雜在核酸鏈中，這些複合物會被雷射誘導螢光偵測到。
Agilent 2100 BioAnalyzer 可與 RNA 6000 Nano 和 RNA 6000 Pico LabChip 套件搭配使用。這款生物分析裝置結合了微流控晶片、凝膠填充通道中的電壓誘導尺寸分離以及微型化的雷射誘導螢光 (LIF) 檢測。十二個樣本可依序處理，而每個樣本的消耗量極小。RNA 分子會被夾層染料染色，並透過 LIF 進行檢測。資料會自動存檔，並以電泳圖、凝膠狀圖像和表格格式提供。
BioAnalyzer 具有良好的線性動態範圍，RNA 6000 Nano 分析儀可用於分析濃度範圍從 25 ng/μL 到 500 ng/μL 的 RNA 樣本。雖然 RNA 6000 Nano 分析法的定量下限指定為 25 ng/μL，但建議至少使用 50 ng/μL，以進行有意義的 RNA 完整性數 (RIN) 計算。當使用較低的濃度時，可能會觀察到較高的樣本間 RIN 差異。
Agilent 2100 BioAnalyzer 軟體用來評估在 rRNA 峰之前、之間及之後檢測到的 RNA 比例，以決定 RNA 樣本的相對完整度數 (RIN)。完整的 RNA 的 RIN 為 10，而完全降解的 RNA 的 RIN 為 1。
部分降解的 RNA（RIN <9）可能會在 RT-qPCR 中產生令人滿意的結果，但這可能取決於分析的目標、所需的靈敏度和 RT 策略。與使用基因特異性引物進行一步式 RT-qPCR 的策略相比，使用寡聚-dT 進行兩步式反轉錄和在長 cDNA 的 5'-end 附近使用 PCR 引物的 RT-qPCR 策略所需的樣本完整性要高得多。我們會詳細討論不同 RT 策略的效果及其對降解模板的容忍度 (請參閱 Reverse Transcription)。此外，若要檢測稀少而非豐富的 mRNA 目標，則需要較高的樣本完整性。因此，也應考慮模板降解對不同豐度的靶點（如測試基因和參考基因）比例的影響。RIN 與 RT-qPCR 成功率之間的相關性應根據每種檢測的經驗來決定。雖然 RIN 大大有助於評估 RNA 製備的完整性，並使比較樣本或 RNA 分離程序變得更加容易，但仍無法預先確定 RNA 是否適合特定實驗。圖 2 顯示了兩個 RNA 樣本的 Agilent BioAnalyzer 軌跡。在使用基因特異性引物進行一步式 RT-qPCR 產生的 cDNA 中，幾個罕見 mRNA 目標的產率並無差異。然而，當使用 oligo-dT 為 RT 引物進行兩步 RT-qPCR 時，完整性較低的樣本 (11, RIN = 7.0) 比品質較高的樣本 (9, RIN = 9.8) 在長達 2 個週期之後仍能檢測到相同的 mRNA 目標，顯示 mRNA 少了 4 倍。
圖二使用 Agilent 2100 BioAnalyzer 評估 RNA 完整性的電泳圖。總 RNA 製備樣本 (~150 ng) 在 RNA 6000 奈米晶片上分離，並使用 Agilent 2100 解析。完整性經評估後歸類為 RIN
樣本的品質至關重要，因此必須在 qPCR 分析中使用樣本之前進行驗證。已經清楚地證明，分析降解的 RNA 樣本可能會導致品質不佳的資料1，儘管情況並不總是如此8 ；且部分取決於 RT 協定 (Reverse Transcription)9。
雖然毛細管系統比傳統的凝膠電泳有了很大的改進，但它們是專門的設備，價格昂貴，而且不適合高通量。圖 3 顯示在裸露的人體皮膚上培養 1 分鐘的樣本，在使用 Agilent BioAnalyzer 分析總 RNA 時，意外地顯示明顯沒有降解。使用另一種方法來判斷降解情況時，發現這些樣本含有降解的轉錄物（見下圖）。
圖 3.使用 Agilent 2100 BioAnalyzer 進行毛細管電泳解析的總 RNA (~150 ng) 電泳圖。分析前，RNA 已在裸露的人手上培養 1 分鐘。分析 RIN 為 10 表示 RNA 質量良好且完整無損。
因此，謹慎解讀 RIN 和其他自動產生的樣本完整性量測結果，並考慮額外的特定轉錄本調查，是非常重要的。其中一種方法是使用兩種獨立的檢測方法來測量目標。完整性檢測依賴於測量位於同一轉錄本 5「和 3」的目標物數量比率（圖 4）10。這提供了轉錄本特異性 RNA 完整性的相對量度（3'/5' 分析協議，請參閱 附錄 A）。
圖 4.cDNA 是使用 oligodT primed RT 從總 RNA 製作而成。針對相同的轉錄本設計了兩種 qPCR 分析，探針使用不同的螢光基團標記，以便進行多重檢測。如果 RNA 是完整的，5「和 3」 分析的檢測結果應該相同，而如果 RNA 已經降解，3「 分析的檢測結果會比 5」 分析高。
以這種方式，3'/5' 比率檢測可用來評估 RNA 樣本的品質。在 圖 5中展示了這種方法的使用，方法是測試 圖 3中所示的 RNA 樣本中 GAPDH 轉錄物的狀態（在任何特定實驗中都應該測試特定的檢驗目標）。在寡聚-dT 引物 cDNA 合成後，使用 5「 和 3」 分析對 GAPDH 轉錄本進行定量。
圖 5. 鑑定降解 RNA 樣本的 3'/5' 分析示範。雖然 Agilent 2100 BioAnalyzer 的分析結果顯示這兩種 RNA 樣本的 RIN 都是 10，但 3'/5「 分析法卻顯示在人手上培養 1 分鐘後，樣本的 5」 分析法損失了 9 Cq （約 1,000 倍）（1「 降解），而 3」 則維持不變。
使用 Agilent 2100 BioAnalyzer 分析 RNA 得出的結論是，圖 3 Figure 3 中顯示的 RNA 是完整的，在裸露的人手上培養 1' 後的 RNA 和降解前的相同純化樣本的 RIN 都是 10。當應用 3'/5「 分析法時，3」分析法顯示兩個樣本的 Cq 相同，而 5「 分析法則顯示 9 個週期的損失，顯示 GAPDH 5」 損失 1,000 倍，轉錄本已降解。這個觀察結果支持了 rRNA（RIN 演算法的重要組成部分）的狀態並非 mRNA 完整性的可靠指標的證明。然而，3'/5' 分析作為整體樣本品質量測的可靠性取決於個別轉錄本的降解速度11。為了檢驗這一點，從 HT29 細胞中提取的 RNA 在室溫下孵育 72 小時，或在 62 °C 下孵育 2 小時。所有樣本的品質都使用 Agilent 2100 BioAnalyzer 進行分析。還針對 13 個普遍表達基因的 3「 和 5」 區域設計了檢測方法，使用這兩種檢測方法測定每個基因在純化、高品質未降解 RNA 樣本 (HT29) 中的靶點數量 (圖 6A)。
圖 6A.使用 3'/5「 分析法判定 RNA 品質 a) 使用 oligo-dT 反轉錄自 RIN 約 10 的 HT29 細胞的 RNA 樣本，並判斷 13 個基因 (X 軸) 的 3」/5' 比率 (y 軸)。當兩種檢測方法都用於同一目標且 RNA 質量高時，定量普遍存在 3' 偏差。不同基因的偏倚程度不同，因此會影響基因之間比率的釐定，例如在對參考基因進行標準化時。(資料由英國 Stephen Bustin 教授提供)
圖 6B.使用 oligo-dT 反轉錄自 RIN 約為 7 的 HT29 細胞的 RNA 樣本，並確定 13 個基因（X 軸）各自的 3'/5' 比率（y 軸）。當兩種檢測方法都用於同一目標，且 RNA 質量高時，定量存在強烈的 3「 偏差，與圖 7.6A 中展示的比率相比，存在明顯的 3」 偏移。不同基因的偏移程度明顯不同，顯示不同基因的降解速度不同。(數據由英國 Stephen Bustin 教授提供)
圖 6C.使用 oligo-dT 反轉錄自 RIN 約為 5 的 HT29 細胞的 RNA 樣本，並確定 13 個基因 (X 軸) 的 3'/5' 比率 (y 軸)。複製的數據差異很大。(數據由英國 Stephen Bustin 教授提供)
當使用高品質的 RNA 時，複製品的數據非常接近，但對於許多基因來說，顯然在檢測中有高達 10 倍的偏差，通常偏向於 3'，而 UBC 的偏差更高達 100 倍。這可能反映了由於模板折疊或其他 RT-PCR 影響因素造成的降解或檢測的差異。有些靶點在檢測時似乎有 5' 的偏差，這可能是由於檢測效率的差異或 RT-qPCR 檢測的其他成分造成的。然後，使用來自 RIN 為 7.3 和 5.3 的 RNA 的 cDNA，用這些檢測方法來量化相同的目標（分別為圖 6B and 6C ）。在使用中度降解（RIN 7）的 RNA 樣本時，有明顯的降解跡象，大多數基因顯示出 10 到 1,000 倍之間的 3「 位移，表明這些轉錄本在 3」 和 5' 分析之間發生了降解。有趣的是，有三個基因顯示出 5「 轉移，這可能表示降解導致構象改變，使得 RT 或 5」 qPCR 更有效率。由於每個基因的變化都不同，很明顯使用 RIN 9 RNA 測量的基因間比率與使用 RIN 7 RNA 測量的比率會有很大差異。使用 RIN 5 的 RNA 時，變異程度較高，每個基因的 3'/5' 比率平均約為 1。由於高品質的完整 RNA 也會有 3'/5「 =1 的平均值，因此這套系統適用於中度到顯然沒有降解的 RNA 樣本的完整性測定，而且除了用於凝膠或毛細管電泳之外，也是一種改進。
在檢測中觀察到的 5」 偏差令人好奇。理論上，對於效率相同的檢測，不可能產生比 3「 更多的 5」 擴增子。顯然有其他因素影響這些檢測的不同效能。另一個樣品品質考量是污染物的存在，這些污染物可能會抑制或甚至增強 RT 或 qPCR 的效能，以及這些污染物是否具有基因靶標特異性。
污染
在 PCR 分析的範圍內，污染的主要形式是樣品中不適當存在的核酸模板，這些模板也可能與特定目標一起被檢測出來，並導致假陽性；或是可能抑制下游反應的物質，造成假陰性或較低的模板濃度估計值。
模板污染
PCR 检测特别容易受到感兴趣的特定目标序列的扩增子污染，因为 PCR 过程会以指数方式产生扩增子的拷贝。因此，執行 PCR 分析的過程會為未來的 PCR 分析產生完美的污染物。在分子生物學實驗室中，必須將設定和執行反應的空間與 PCR 產物將被分析和進一步處理的 PCR 後分析區分開。在可能的情況下，最好使用具有專用設備和實驗室外套的獨立房間，以避免 PCR 後分析區域的任何物品接觸到乾淨的（PCR 前）區域。許多實驗室還對進入這些區域的人員實施進一步控制，以防止反應攜帶。
除了 PCR 產生特定的擴增片段外，實驗室的設置也需要小心，以確保原始的模板材料不會從一個樣本轉移到另一個樣本（交叉污染），或者在分析人類樣本的情況下，不會從進行分析的人員身上帶入材料。
強烈建議採用標準的實驗程序，並搭配適當的控制，以找出潛在的污染來源。
RNA受gDNA污染
分析RNA時，必須確保沒有gDNA污染。建議使用溶液中的 DNase I 對樣本進行酵素處理，以去除污染的 gDNA，這對於研究無內含子基因或檢測設計無法區分 gDNA 與 cDNA 序列時尤其重要。在可能的情況下，建議在內含子/外顯子邊界上設計檢測方法，以便僅能擴增和/或檢測處理過的 mRNA 序列。這並不總是可以防止來自 gDNA 的擴增，因為有些序列是經過處理的偽基因，實際上是基因組 cDNA 序列（請參閱 PCR/qPCR/dPCR 分析設計）。還值得考慮的是，DNA 存在於試劑中，可能會造成污染問題12。
抑制。抑制
抑制劑的存在會對不同靶點的 qPCR 分析產生不同的影響13。因此，樣品中抑制劑的存在可能會導致真實數據的複雜擾動。由於每種檢測受到的影響不同，因此得出的感興趣基因 (GOI) 與參考基因數量的比率可能無法反映每種基因的真實豐度，導致相對靶點數量的估計不正確，或難以解釋基因分型檢測。
在實驗過程中常引入的 PCR 抑制劑包括：三氫、乙醇、異丙醇、EDTA、逆轉錄酶酶、異硫氰酸胍和苯酚。
可以用來檢測抑制劑的一個系統是 SPUD 分析14 （圖 7）。使用此方法，在有水（擴大對照； 圖 7 樣品 a）或測試樣品（圖 7 樣品 b 和 c）的情況下，對人工擴增子（來自與任何其他已知序列缺乏同源性的馬鈴薯核酸序列）進行 qPCR。如果測試樣本不含 SPUD 分析的抑制劑，擴增對照和測試樣本記錄的定量週期 (Cq) 將相同。但是，如果測試樣本含有抑制劑，Cq 將增加（詳細的測試規程提供為 SPUD Protocol, Appendix A).
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圖 7.7.SPUD 分析的示意圖。在這種情況下，樣品 c 與對照樣品 a 之間的 Cq 差異顯示存在抑制劑。
一個整合的範例：分析 RNA 樣本品質
前文所述的每一種樣本品質控制方法都是用來判定樣本的特定特徵。本節包含可應用於樣本的範例工作流程說明，並說明每個品質控制測試所提供的資料。
已製備了五個 RNA 樣本，依序標示為 A 至 E。這些樣本使用 NanoDrop 進行分析，發現濃度非常接近（約 100 ng/μL）。使用每個樣品的兩個獨立讀數記錄了兩次 A260/A280 ratio (圖 8)，發現在所有情況下都約為 1.值得注意的是，此分析中沒有 A230 nm 讀數。使用毛細管電泳（Agilent 2100 BioAnalyzer）進行的分析顯示出不同的畫面（圖 9）。樣品 A 和 B 的品質很高（RIN 為 10，濃度為 110 ng/μL，與奈米滴定儀的讀數一致），樣品 C 的降解程度很高（RIN 為 2.4，濃度為 62 ng/μL，是奈米滴定儀測定濃度的一半），樣品 D 和 E 的品質很高（RIN 分別為 9.1 和 9.5），但濃度比樣品 A 和 B 低（分別為 30 ng/μL 和 43 ng/μL）。由於 NanoDrop 無法顯示降解情況，因此這兩種測量方法所得到的資訊在某種程度上是互補的。但也有衝突，因為 D 和 E 樣品的濃度相差很大。這將會引起關注，並應引發進一步的調查。雖然毛細管電泳是評估樣品的有力工具，但它的處理量相對較低，並非所有研究人員都能使用。3'/5' 分析是樣本完整性的另一種測試方法。根據 NanoDrop 讀數，使用等濃度對樣本 A-E 進行此測試。使用這種方法測試這些樣本時，很明顯，樣本 A（圖 10A）和 B（數據未顯示，與樣本 A 相同）的 RNA 是完整的，而樣本 C 的 RNA 則高度降解（圖 10B）。請注意，對於樣本 C，5「和 3」分析的 Cq 已經顯著轉移到較高的值，表明相對於樣本 A 和 B，特定目標的損失。樣品 D 和 E 的剖面與預期不符（圖 10C 顯示樣品 D，樣品 E 的數據未顯示，但相似），因為 5'檢測的 Cq Figure 10C 顯示的是樣品 D，但沒有顯示樣品 E 的數據，但情況類似。另一種解釋是，這些樣本含有抑制劑，對 3「 分析的影響比 5」 大。為了測試這個理論，我們在所有樣本上執行 SPUD 分析（圖 11）。
根據所有資訊，我們可以得出結論，每個樣本中的核酸物質濃度相同（NanoDrop），而且樣本中含有無法檢測到的污染物，其吸收波長為 280 nm（蛋白質）（未測試其他波長）。樣本 A 和 B 的完整性很高，沒有檢測到抑制劑；樣本 C 的降解程度很高（毛細管電泳和 3'/5「 分析），沒有檢測到抑制劑；樣本 D 和 E 的完整性很高，但含有 PCR 抑制劑（3」/5' 和 SPUD）。
圖 8.NanoDrop 品質評估 (A260/A280)。
圖 9.Agilent 2100 生物分析儀分析 RNA 樣本 A-E。
圖 10A.GAPDH 3'/5' Multiplex Assay RNA 樣本。
圖 10B.GAPDH 3'/5' Multiplex Assay 樣本 C.
圖 10C.GAPDH 3'/5' Multiplex Assay 樣品 D.
圖 11.樣品 A-E 的 SPUD 分析。
參考資料
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