重組細菌的鑑定
藍白篩選是一種快速有效的重組細菌鑑定技術。它依賴於β-半乳糖苷酶的活性，β-半乳糖苷酶是大腸桿菌中的一種酶，可將乳糖裂解為葡萄糖和半乳糖。
干擾 LacZ 基因
周圍環境中存在的乳糖會觸發大腸桿菌中的 lacZ 操作子。該操作子的活性會產生β-半乳分解酵素，以代謝乳糖。大多數的質粒載體都帶有一段很短的 lacZ 基因，它包含了 β-galactosisdase 前 146 個氨基酸的編碼資訊。所用的宿主 大腸桿菌 菌株是含有lacZΔM15缺失突變的合格細胞。
用於克隆的質粒載體是以這樣的方式來操作的，即這種 α-互補過程可作為重組的標記。在質粒載體的 lacZ 序列中存在一個多重克隆位點 (MCS)。此序列可被限制性酵素切斷以插入外來 DNA。當含有外來 DNA 的質粒向量被宿主 大腸桿菌吸收時，α-互補不會發生，因此不會產生功能性的β-半乳糖苷酶。如果外來 DNA 沒有插入到載體中，或者插入到 MCS 以外的位置，質粒載體中的 lacZ 基因會補足宿主 大腸桿菌 E.
藍白篩選是如何進行的？
為了篩選含有重組 DNA 的克隆，需要在瓊脂平板中加入一種稱為 X-gal 的顯色底物。如果產生了 β-半乳糖苷酶，X-gal 會水解形成 5-bromo-4-chloro-indoxyl (5-溴-4-氯-茚三酮)，它會自發地二聚產生一種叫做 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo 的不溶性藍色色素。因此，由非重組細胞形成的菌落呈現藍色，而重組細胞則呈現白色。
異丙基 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 與 X-gal 一起用於藍白篩選。IPTG 是一種不可代謝的半乳糖類似物，可誘導 lacZ 基因的表達。需要注意的是，IPTG 不是 β-半乳糖苷酶的底物，而只是一種誘導劑。為了目視篩選的目的，需要 X-gal 之類的發色底物。
圖 1.可用於藍白篩選的典型質粒載體示意圖。
圖 2.典型藍白篩選程序的示意圖。
藍白篩選產品（材料）
藍白篩選的方案
藍白篩選的完整方案包括 3 個重要步驟：
- 連接：將外源DNA連接至質粒載體的MCS中
- 轉換：將帶有外源DNA插入物的質粒載體導入有能力的 大腸桿菌 中。大腸桿菌
- 篩選：藍白篩選以鑑定重組細菌菌落
Ligation
我們提供以下即用型表達載體，可用於穩定和瞬間表達系統。這些FLAG融合建構體具有複製起源，可在細菌和哺乳類動物細胞中繁殖。
所需材料
以下是進行結合的反應設定
。- 將上述所有成分加入乾淨的反應管中。
- 在 25 °C 下培養 30 分鐘（可在熱回旋器中進行）。
- 使用 PCR 淨化柱淨化 DNA，並以約 50 µL 的量洗脫。
- 將 0.1-10 ng 的結合產物轉換到與載體相容的化學或電化能力細胞中。
變形
。高品質的質粒對於轉換過程是不可或缺的。以下試劑盒可分離和純化適合轉換的高品質質粒。
篩選
我們提供一系列有助於重組細菌篩選的顯色底物。有些產品可用於塗佈在 LB 瓊脂平板上（篩選方案 1），而其他產品則納入微生物培養基（篩選方案 2）。在需要時，這些產品會與 IPTG 一起使用。兩種程序的步驟如下。
篩選規程 1（適用於產品編號 B6650, 16658, B2904, B3928, 16669, B8931)
- 使用無菌擴展器在 LB 瓊脂平板上擴展 40 µL 或適量的發色底物儲備溶液和 10 µL IPTG 溶液（使用產品編號 B3928 時不需要添加 IPTG，因為它已經含 IPTG）。
- 平板應包括含有適當抗生素和不含抗生素的平板作為對照。
- 將平板放置在層流室中稍稍打開蓋子晾乾。
- 在 37 °C 下培養 24-48 小時。
- 瓊脂表面出現藍色和白色的菌落。選擇白色菌落中的重組細胞進行培養。
篩選方案 2（適用於產品編號 S7313, S9811, ；C4478）
- 在無菌燒瓶中稱量適當的粉末培養基、瓊脂和水，製備 LB 瓊脂。或者，稱取適量的 C4478 ，加入到無菌瓶中的水中。
- 在高壓滅菌前，向培養基中加入 300 mg/L 的產品編號 S7313 和 S9811，以及 500 mg/L 的檸檬酸鐵銨（產品編號 F5879）。
- 在培養基中加入適當濃度的選定抗生素。
- 將大約 25-30 mL 的 LB 瓊脂倒入無菌平板中，蓋子稍微打開，待其凝固。
- 使用無菌擴展器將 10-100 µL 已轉化的大腸桿菌 細胞擴展到 LB 瓊脂平板上。
- 在 37 °C 下培養平板 24-48 小時。
- 瓊脂表面出現藍色和白色菌落。選擇白色菌落中的重組細胞進行培養。
圖 3.使用 X-gal 進行重組細菌的藍白色選擇。
藍白篩選的限制
- 藍白技術只是一種篩選程序，它不是一種選擇技術。
- 載體中的lacZ基因有時可能沒有功能，不能產生β-半乳糖苷酶。
- 即使一小段外來 DNA 插入到 MCS 中，也可能改變 lacZ 基因的閱讀框。
- 在lacZ閱讀框內的小序列插入可能產生模糊的淡藍色菌落，因為β-半乳糖苷酶僅部分失活。
參考資料
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