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將有興趣的基因克隆到質粒向量中

Oxford Genetics

 

Selecting the Cloning System and Plasmid Vector

全世界成千上萬的實驗室都在使用基因工程。鑑於其重要性，許多常用 DNA 成分的克隆策略並未標準化，實在令人詫異。

牛津基因公司的目標是設計一個 DNA 質粒系統，它可以在單一質粒內容納研究人員可能需要的大多數功能 DNA 插入。透過優化我們的起始載體，我們系統中的每個 DNA 部分都可以移除，並交換成數百個我們事先設計和測試過的其他 DNA 部分。這就是 SnapFast™ 的概念。我們所有的構建物都經過預先篩選，以確保不會出現編碼子使用不當和限制位點衝突的情況。在可能的情況下，罕見的編碼子和限制位點已被移除，以實現高效率的表達，並確保限制位點不會限制其他 SnapFast DNA 片段的克隆。

我們擁有全球最大的質粒庫之一，幾乎可以為我們提供的每個插入物提供多種表達和克隆選擇。我們的產品範圍包括

  • 任何地方最大的多肽標籤範圍（26 個）
  • 5 種配置中共有 9 個報告基因
  • 20 多個信號肽超過 40 個啟動子，用於哺乳類動物、細菌和酵母的表達
  • 總共 10 種抗生素和代謝選擇選項
snapfusion-overview

SnapFast系統的優點

  • 所有質粒與標準克隆、LIC、InFusionHD、Gibson Assembly、Seamless Geneart相容。
  • 超過 1600 種獨特的 DNA 片段可用且相容。
  • 簡易、有效率且簡單的工程策略。
  • 由於預先設計的相容性，因此成功率高。
  • 與許多已有的克隆載體和一系列穿梭載體相容，方便基因轉移。
  • 容易從 SnapFast 向量克隆到一系列替代系統，包括病毒載體。
  • 內置調控序列和功能（例如基因共聚、絕緣體和終結序列）。

* 需要使用同源或 TypeIIS 位點設計引物
** 專利限制了克隆技術或產品的使用
^ 線上提供的工具可幫助設計
LIC = Ligase Independent Cloning

質粒限制性消化

製備性消化是切割 DNA 以準備與另一片 DNA 進行連接，而不只是確認 DNA 的身分。您應該以同時對片段和載體進行消化為目標。這將節省您的時間。本方案假定在 Tris-EDTA (TE) 或洗脱缓冲液 (EB) 或不含核酸酶的 H2O 中的质粒溶液为 200-300 ng/µL，约 3-5 kb。較大的質粒可能需要使用較多的容量，因為在相同濃度下，質粒的拷貝數較少。

在這個特殊的例子中，可以做以下的工作：

10-20 µL 质粒（200-300 ng/μL，总量 3-5 µg）
10 µL 10X 限制缓冲液
10 µLL 的 10X 牛血清白蛋白 （BSA，最終濃度通常為 100 µg/mL）（目錄編號. A7906)
1.5-2µL限制酶1（10-20單位/µL）
1.5-2 µL Restriction Enzyme 2 (Optional)
用 TE (Catalog No. 無核酸酶水 (Catalog No. W4502)

在無菌的 1.5 mL Eppendorf 中加入上述試劑，首先加入 TE 或水，然後加入質粒/DNA，再加入限制緩衝液和 BSA，充分混勻。最後加入限制性酵素。選擇的限制性酵素取決於您的目標和質粒圖譜，但可能包括 EcoR I、BamH I 或 Hind III。將反應培養在適當的溫度（通常是 37 °C，但一定要確定您處理的不是例外，例如 SwaI 在 25 °C），並開始鬧鐘（向上數）。將反應運行 40-60 分鐘。現在您可以使用鹼性磷酸酶 (CIP) 對載體進行去磷酸化處理。

在瓊脂糖凝膠（有一個很大的孔，用來載入大量樣本）上運行消化，檢查結果是否有與線性化質粒大小相同的單一條帶。這個消化有三種可能的結果：

  • 完全沒有作用。因為反應失敗，所以沒有必要再消化下去。如果酵素之前在另一個質粒上起過作用，也許可以重新沉澱您要切割的質粒，或者在沉澱之前做一個新的酚提取，然後再試一次。
  • 酵素已經起效，但在 40 分鐘之後，載體仍未完全切斷（顯示為在您期望的載體大致分子量上，有一條以上的帶出現）。您可以根據進度估計還要多久，然後再嘗試另一次消化。
  • 已經完全消化。您有一個線性質粒，可以用於結合程序中。

提示： 限制性酵素對溫度變化非常敏感，因此避免將其放在冰上。最好使用 -20 °C 的冷藏箱。此外，避免用手指握住試管底部，並在處理酵素庫存時盡量快速工作。如果您悉心照料，它們可以保存很長時間。

片段限制消化

這是一個製備性消化的方案，也就是切割 DNA 以準備與另一片 DNA 結合，而不只是確認 DNA 的身分。通常這些 DNA 片段是環狀質粒，但也可能是 PCR 片段。您應該以同時消化片段和載體為目標。

本方案假定在 Tris-EDTA (TE) 或洗脱缓冲液 (EB) 或不含核酸酶的 H2O 中的质粒溶液为 200-300 ng/µL，约 3-5 kb。較大的質粒可能需要使用較多的容量，因為在相同濃度下，質粒的拷貝數較少。

在這個特殊的例子中，可以這樣做：

10-20 µL 的質粒（200-300 ng/μL，總量 3-5 µg）
7.5 µL 的 10X 限制緩衝液
7.5 µL 的 10X 牛血清白蛋白 (BSA，最終濃度通常為 100 µg/mL) (Catalog No. A7906)
1.5-2 µL 限制酶 1(10-20 u/µL)
1.5-2 µL Restriction Enzyme 2 (Optional)
用 TE (Catalog No. 無核酸酶水 (Catalog No. W4502)

DNA 片段限制性消解協議

在無菌的 1.5 mL Eppendorf 中，先加入 TE 或水，再加入質粒/DNA，然後再加入限制性緩衝液和 BSA，充分混勻。最後加入限制性酵素。將反應培養在適當的溫度 (通常是 37 °C，但請務必確定您處理的不是例外，例如 SwaI 在 25 °C)，並開始鬧鐘 (倒數)。將反應進行 40-60 分鐘。在瓊脂糖凝膠上進行消化（有一個非常大的孔，可以載入大量樣本），檢查結果是否有與插入物大小相同的單一帶。

Gel Excission of DNA Fragments

要切除條帶，您需要乾淨的手術刀或刀片。一個重要的考慮因素是您帶有 DNA 的瓊脂糖量。

從琼脂糖凝膠中提取 DNA 的標準方法是用紫外光照射溴化乙锭（目錄編號 H5041）染色。這種方法並不理想，因為紫外線會破壞 DNA，造成突變，並會降低結合效率。另一種方法是使用 Clare Chemical Dark Reader Trans-illuminator，但有時很難看到低量的帶。如果您有大量的 DNA，這些系統是理想的選擇。另外，您也可以進行盲切，將少量切下的 DNA 放到大孔相鄰的泳道中，然後在下一孔中利用其位置切下大量 DNA。使用此技術時要非常小心，因為有些帶在凝膠中的長度/頂端到底部可能相當小，如果您不精確，可能會漏掉。切除之後，您可以檢視剩餘的凝膠，看看您是否得到了帶子，做的時候要快，因為如果您沒有得到 DNA，您不想用紫外線傷害它。這項技術的關鍵在於將載體骨架與片段分離，以防止污染。

提示： 就分子生物學而言，這是一個相對危險的過程。紫外線、致癌的溴化乙啶和手術刀都是災難的根源。

提示： 考慮選擇更安全的化學品來觀察 DNA。01494）都是安全的。 S9430)已被證明比溴化乙啶的致突變性更低。

凝膠片段的清理

要從瓊脂糖凝膠中提取DNA片段，除了使用預先準備好的試劑盒外，通常不值得使用任何其他試劑盒，例如 GenElute™凝膠提取試劑盒，目錄編號：GenElute™ Gel Extraction Kit。 NA1111。這些方法相對便宜且非常有效。也有其他不需要試劑盒的方法（例如透析管和在parafilm之間擠壓凝膠片段，擠出溶液中的DNA），但使用這些方法通常會造成污染物含量高和DNA產量低的問題。

DNA凝膠萃取試劑盒通常由珠子或旋轉柱組成。每種試劑盒可容納的 DNA 片段大小各不相同，因此請檢查試劑盒是否可提取您正在處理的 DNA 大小範圍。

旋轉柱和珠子試劑盒的原理都是將 DNA 與某種物質（通常是矽樹脂）結合，然後通過將珠子造粒或清洗柱子來洗去雜質。最後的洗脫步驟會將 DNA 從樹脂/珠子/柱中釋放出來，為您提供乾淨的 DNA 片段。然而，即使是最好的萃取試劑包仍會攜帶一些雜質，因此，在結合過程中應避免使用大量凝膠萃取產生的溶液。將片段加入結合時，有時「少加就是多加」。

凝膠萃取套件的變異性

我們在實驗室中對六種不同的 DNA 凝膠萃取套件進行了正面對面的測試，因為這個過程對我們的工作非常重要。我們發現，有些套件可以持續提供高產量和純淨的 DNA，有些套件有時可以提供良好的產量，但有時會失敗，而有些套件則持續表現不佳。

如果您從質粒中凝膠萃取一個片段，您可能應該預期 DNA 濃度數值（如果使用分光光度計）會很低，因為您一開始使用的是一個很大的質粒（很可能約 5kb），然後切出一個小得多的子片段（也許是 1kb），而且試劑盒永遠不會從凝膠中純化出 100% 的 DNA。因此，從 5ug plamsid DNA（5Kb）中分離出的 1Kb 片段，在 35ul 總容量中的產率為 20ng/ul 並不算太差（70% 的 DNA 已經被回收）。

我們經常發現，雜質含量或 DNA 預製品質往往比 DNA 產率本身更能決定克隆成功與否。我們也持續觀察到，有時在結合過程中加入更多的片段，會比同一個反應中加入稍少的片段降低克隆成功率。雖然，這可能只是因為額外的 DNA 末端將連接劑滴離了向量末端，但加入太多的凝膠萃取物可能是因為凝膠預備物中的污染物含量低。

Annealing DNA Oligos for Ligation

退火寡核苷酸的基本概念是加熱兩個寡核苷酸，使它們變性，然後冷卻一段時間，讓兩個寡核苷酸進行碱基配对。有關自訂寡核苷酸，請參閱 OLIGO）。這個過程通常用來製備短的 DNA 區段，以便：

  • 製作 shRNA DNA 區段供結合使用
  • 製作 microRNA DNA 區段供結合使用
  • 加入連結器以移除或加入限制位點。
  • 需要小型雙股 DNA 區域的研究，例如 DNA 蛋白質結合測試。

購買大量磷酸化寡核苷酸的成本可能過高。因此，許多研究小組只需將寡核苷酸結合到未去磷酸化的載體中。當寡核苷酸要連結到一個已經用兩種不同的限制性酵素切割的載體中，而這些限制性酵素有不相容的末端（防止載體自行閉合）時，這個方法就特別有效。

也可以使用多核苷酸激酶 (PNK) 先將寡核苷酸磷酸化，但清理寡核苷酸很困難，因為寡核苷酸很可能因其短而無法與 DNA 清理柱結合。不過，PNK 反應是在連接酵素緩衝液中進行的，因此可能不需要這樣做，但在寡聚物放入連接之前，必須先將 PNK 加熱滅活，否則 PNK 會使您的向量磷酸化。

磷酸酰胺化學通常用來製造寡聚體，通常可依靠此技術製造出 40-50 個基本位元的寡聚體，而不會有太多的錯誤，然而，使用此技術製造 100 個基本位元或更長的寡聚體，往往會導致突變。我們經常發現，將一個長的寡核苷酸分成兩個較短的寡核苷酸，中間在對立的寡核苷酸上有 10-15 個碱基對重疊，讓它們接合在一起會比較好。您在測序之後得到的突變頻率應該會低很多。

退火 DNA 寡組進行連接

考慮冷卻步驟。我們嘗試在水浴中冷卻寡核苷酸，方法很簡單：先將水浴加熱到 95 度，然後關掉水浴進行冷卻，或者將寡核苷酸放在三腳架上的燒杯中加熱到 100 度（老式方法），然後將燒杯放入冰水中（寡核苷酸仍然放在燒杯中的管子中）進行冷卻。我們也試過把寡核苷酸放在 PCR 機中，每 30 秒冷卻 5 度。實際情況是，方法的差異並不大。在高溫下放置太久可能會導致水解，因此我們避免直接關閉水浴。一般而言，我們會將寡核苷酸在水浴中加熱至 95 度，並將管中的寡核苷酸放在一個浮子上的 eppendorf 燒杯中。然後放入冰水中 10 分鐘。這對我們來說似乎很有效，但其他方法也可能適用於您。

設計具有overhangs的寡核苷酸來重組要插入寡核苷酸的位點可能很困難。下圖舉例說明寡聚體的外觀，在這個例子中，寡聚體要連接 NcoI 和 XbaI 限制位點。

寡聚物要連接 NcoI 和 XbaI 限制位點。

退火 DNA 寡聚體規範

提示： 寡聚體和引物庫存通常以 100 µM（100 皮摩爾/ul）的濃度重懸。

  1. 在 25 µL 無核酸酶水 (Catalog No. W4502)加入 1.5 mL 微管中。
  2. 加入 5 µL 限制性消化緩衝液（例如 100mM NaCl （目錄編號 S3014）、50 mM Tris-HCl (Catalog No. 93362), 10 mM MgCl2 (Catalog No. M0250)，1 mM Dithiothreitol (Catalog No. D0632)，pH 7.9。緩衝液的存在有助於保持 DNA 穩定的正確 pH 值，而鹽應可促進退火。
  3. 將試管放入預先加熱至 95 度的水中浮動 5 分鐘。
  4. 將燒杯放入裝滿冰和水的冰盒中，讓燒杯冷卻 10 分鐘。
  5. 一旦燒杯中的水冷卻後，將寡核苷酸在水中稀釋 10 倍和 100 倍，然後將其中的 1 µL 加入標準的 20 µL 結合反應中。誘惑是加入更多，但這只會將連接酶從您的載體末端滴定到額外的寡聚體上，這會降低連接效率。結合中寡聚體的最終濃度大約是 2 或 0.2 皮摩爾/微升。這仍會是寡核苷酸對載體的顯著過量。

Adding 5' Phosphates to DNA

T4 DNA 連接酵素需要在其中一個要連接的 DNA 分子上加入 5' 磷酸鹽才能連接 DNA，因此在加入 DNA 分子進行連接之前，例如在鈍化克隆 PCR 產品時，通常需要先將其磷酸化。

無核酸酶水 (Catalog No. W4502)：4.5 ul
PCR 產品或其他 DNA (已清理)：4 ul (if your PCR product has 5' recessed or blunt ends, heat it to 70 °C for 5 minutes and cool on ice before adding it to the reaction)
10 x T4 DNA Ligase buffer：1 ul（使用連接酶緩衝液是因為它含有 ATP）
T4 多核苷酸激酶：0.5 ul

在 37 °C 下孵育激酶反應 30 分鐘。磷酸化的 PCR 產物可直接用於結合反應而不需清理（例如進行定點突變時）。如果 PCR 产物要连接到去磷酸化的载体中，那么热灭活 PNK 酶可能是个好主意，以防止它磷酸化骨架载体并导致高背景。將反應在 65 °C 下孵育 20 分鐘即可達到此目的。

Dephosphorylating DNA

對載體進行去磷酸化的目的，是通過去除 DNA 連接酵素將磷酸二酯 DNA 骨架連接在一起所需的 5' 磷酸基團，防止載體在連接步驟中連接回自身。存在各種鹼性磷酸酶，包括小牛腸磷酸酶 (CIP)、蝦和南極磷酸酶。 CIP (Catalog No. P4978)是最常用的，但很難加熱滅活。不同酵素的溫度和緩衝液可能不同，請參考製造商的說明。

在限制性消化反應中使 DNA 去磷酸化的 DNA 去磷酸化協議

50-100 µgL 的 DNA（5µg）的限制性消化反應/溶液
1-2 µL 的 CIP 酶（1unit/µL）

  1. 在您的限制性消化液中加入 1-2 µL 的 CIP。CIP 在大多數的限制性消化緩衝液中都是穩定且活躍的。
  2. 在 37 °C 下培養樣品 30-60 分鐘。

DNA 去磷酸化協議，在 TE 或 H2O

20-40 µL DNA (5µg) in TE (Catalog No. 核酸酶 H2O (Catalog No. W4502)
5 µL 10xCIP 緩衝液

最多製作 50 µL

  1. 在無菌的 1.5 mL eppendorf 中，先加入 DNA，再加入 CIP 緩衝液，然後再加入 1-2 µL CIP。
  2. 用移液器吸頭徹底混和，在 37 °C 下孵育 30-60 分鐘。

提示 1： 確保您要連接到去磷酸化載體的片段具有 5'phosphate 基團。標準的寡聚體/引物和 PCR 產品通常沒有磷酸化，必須用 T4 多核苷酸激酶處理（請參閱 5' 末端磷酸化）。通常在 PCR 產品的末端加入限制性位點（在末端加上幾個額外的碱基對）比磷酸化片段更容易。

提示 2： CIP 儲存在甘油緩衝液中以保持穩定，但這意味著它會沉到水溶液的底部。加入 CIP 時，請將試管舉到面前，觀察它是否掉入 DNA 混合物中，然後確保它在培養前適當地重新懸浮。

DNA Blunt Cloning Protocols

例如，有時候需要將 DNA 分子的兩端變鈍：

  • 製作DNA文庫時
  • 需要克隆到載體的末端粗糙的剪切DNA

在不可能選擇相容的限制位點的情況下，需要在連接前使載體和插入物或兩者鈍化（可能是最後的辦法）。有兩種選擇：使用 DNA 聚合酶（如 Klenow 或 T4）或綠豆核酸酶。Klenow 和 T4 DNA 聚合酶都會填入 5「 overhangs 並嚼回 3」 overhangs。如果您需要填入 5「 懸空，任何一種酵素都可以，但如果您需要移除 3」 懸空，T4 可能是更好的選擇，因為它有更強的 3「 到 5」 外切酶活性。綠豆核酸酵素可咬回 5「 和 3」 懸空。

Klenow Blunting Protocol

  1. DNA 應該溶解在 1x 限制性消化緩衝液或 T4 DNA Ligase Reaction Buffer 中，並補充 33 μM 的 dNTP [最終濃度]。
  2. 每微克 DNA 加入 1 單位 Klenow，在 25 °C 下孵育 15 分鐘。
  3. 加入 EDTA 至 10mM 的最終濃度，然後在 75 °C 下加熱 20 分鐘，停止反應。

T4鈍化法

  1. DNA應溶於 1x 限制性消化緩衝液 & 並補充 100 µM dNTPs [最終]。
  2. 每微克 DNA 加入 1 個單位的 T4 DNA Polymerase，並在 12 °C 下孵育 15 分鐘。
  3. 加入 EDTA 至 10 mM 的最終濃度，並加熱至 75 °C 20 分鐘，以停止反應。

绿豆核酸酶钝化法

  1. 将 DNA（0.1 μg/μL) 加入 1X 綠豆核酸酶緩衝液或限制性酵素緩衝液中
  2. 每 μg DNA 加入 1.0 單位的綠豆核酸酶
  3. 於 30 °C 孵育 30 分鐘。

切勿嘗試加熱滅活綠豆核酸酶，因為在酵素滅活前可能會出現 DNA 的單股區域，導致非預期的降解。請使用旋轉柱純化或苯酚/氯仿萃取及乙醇沉澱法使酵素失活。

DNA 結合協議

在克隆過程中，所有的道路都通向結合，因此結合之前的所有步驟都會顯著影響其效率。在進行連接反應之前，閱讀每一部分的提示和注意事項是很重要的。

連接反應與對照一起進行。通常你有兩個對照：

  • 單獨的載體不加連接酶（對照未切割的載體）
  • 加連接酶的載體（與對照1一起使用時對照去磷酸化不足）
  • 真正的連接是載體 + 片段 + 連接酶。

如果您在對照 1 上得到了菌落，那麼您的載體限制性消化沒有成功，因為即使沒有連接酶，您也得到了菌落。如果您在對照 2 上得到了菌落，但沒有在對照 1 上得到，那麼您的鹼性磷酸酶處理沒有成功。這是因為您的消化效果很好（對照 1 上沒有菌落），但是連接酵素能夠重新使質粒環狀化，因為在去磷酸化過程中 5' 磷酸鹽沒有被去除。如果您在對照 3 上得到了菌落，而在對照 1 和對照 2 上卻沒有（或只有較少），那麼您應該恭喜自己，挑一些菌落回家喝杯茶慶祝一下。

不同實驗室的反應條件可能會有所不同。最佳結果是在 16 °C 下過夜，但這意味著整個過程要多加一天（使其成為 4 天的克隆週期）。在室溫下進行 1-2 小時的結合通常會得到很好的結果，並將整個克隆週期縮短至 3 天。

最困難的兩種連接方式是連接 PCR 產物和鈍化連接。

一個典型的反應可以設定如下：

  1. 開始設定反應，加入所有反應共用的成份，也就是先加入水，然後再加入緩衝液，最後再加入載體到每個試管中。由於 DNA 結合酶對剪切力敏感，因此不要攪拌反應。取而代之的是，用您加入連接酵素的吸頭攪拌均勻，和/或用手指輕輕地反覆搖動試管。有些人會在 65 °C 下加熱滅活 20 分鐘，但嚴格來說，這並非必要。
  2. 一旦完成連接，就使用質粒來轉換細菌，這樣您就可以直接表達蛋白質，或培養多份質粒 DNA 以供進一步使用。

提示 1： 結合緩衝液中的 BSA 可能會在冷凍解凍時析出，在緩衝液底部可見白色沉澱物。

提示 2： 连接酶缓冲液中含有 ATP，多次冻融循环后会降解。

提示 3： 在加入酶之前，將結合溫度加熱到 37 °C 數分鐘，打開黏性末端，或者在使用單限制位點結合時，幫助線化瞬間重螺旋化的載體。在加入酵素前，先將結合物冷卻至室溫，以避免在加入酵素時損壞連接酵素。

提示 4： 据报道，在连接前用蛋白酶 K 处理 PCR 产物有助于连接。

提示 5： 從凝膠中提取 DNA 時，避免將其暴露於紫外線下。

提示6： 避免使用超過總結合體積20-30%（通常總體積為20 μL）的凝膠純化材料。

提示7： 如果在琼脂糖凝胶上运行，载体的量应该几乎看不到，所以大约20-30纳克。片段應該比較多，但濃度不能超過載體的 5-10 倍。

計算插入物與載體的比例

插入物與載體的摩爾比對於結合結果和後續的轉化步驟有顯著的影響。摩爾比可以從插入物與載體的1:1到10:1不等。可能有必要同時嘗試幾種比例以獲得最好的結果。下面的計算將告訴您在 6:1 的比例（片段：載體）下，片段與載體之間的關係。將 3 改為任何值，即可計算出其他濃度。

結扎計算器

位點導向突變演算法 (SDM) 是在特定位點將特定突變導入質粒的有用技術。突變可以是取代、插入或刪除。SDM 有許多應用，例如評估酵素中某些胺基酸的功能、研究改變啟動子中的碱基或移除質粒上的限制位點的效果。

在此我們描述一種以 PCR 為基礎的位點定向變異方法。其基本原理是設計一對背靠背的 PCR 引物，使整個質粒都能被 PCR 擴增。其中一個引物包含了所需的突變。PCR 產生線性產物，其末端可用 DNA 連接酵素接合（磷酸化後）。

步驟 1：突變過程和引物設計

設計一對引物，在其中一個引物的 5' 端加入您想要的突變。設計引物時要使互補區域的 Tm 約為 60 °C。

誘變

請注意，只有正向引物包含突變，因此您可以透過保持反向引物相同但使用不同的正向引物，輕易地做出一系列不同的突變。上面的例子是 3 bp 的取代，但插入也可以用同樣的方法製作。

如果您需要非常大的取代或插入，那麼可以在兩個引物的 5' 末端都引入突變基序。

任何大小的刪除都可以通過在模板上將正向引物和反向引物隔開來實現。這意味著 PCR 產品的末端不能簡單地連接在一起，它們必須先磷酸化。這主要有兩種選擇：1) 您可以訂購 5' 端已加入磷酸鹽的引物，或 2) 您可以使用多核苷酸激酶 (PNK) 將 PCR 產品磷酸化。如果您只做幾個 SDM，而冰箱裡又沒有 PNK，磷酸化引物是個好主意（另外還減少了一個步驟）。

步驟 2：PCR

使用校對聚合酶以避免引入任何其他突變是很重要的。話雖如此，如果您還是擔心會導入突變，您可以在誘變之後將突變的片段子克隆回相同的骨架中。

因為這個方法是以 PCR 為基礎，所以在較小的質粒上往往效果較好。最好按照聚合酶附帶的說明進行，但要設置一個類似這個例子的 PCR：

35.5 μL 水
5 μL 10x 聚合酶緩衝液
1.5 μL 正向引物（0.3 μM final)
5ul dNTPs (200 μM final)
1ul Template DNA (a 1 in 100 dilution of a minii-prep)
0.5μL聚合酶

將反應置於冰上，混合反應後直接將試管移到預先加熱的 PCR 區塊。

PCR 程序：

  1. 98 ℃ 60 秒
  2. 98 ℃ 8 秒
  3. 55-65 ℃ 20 秒
  4. 72 ° C（延伸時間取決於恆溫條件）。C (延長時間取決於質粒大小和使用的聚合酶類型) 重複/循環步驟 2-4 再 27-30 次
    572 °C 5 分鐘

室溫恆溫。

琼脂糖凝膠)。

步驟 4：磷酸化 5' 末端

*如果您在 PCR 中使用了磷酸化寡核苷酸，則可以省略此步驟。

4.5 μL 無核酸酶水 (Catalog No. W4502)
 PCR 产物
1 μL 10x T4 DNA Ligase buffer*
0.5 μL T4 多核苷酸激酶

37 °C 孵育 40 分鐘。

*使用配位酶緩衝液，因為緩衝液中已含有 ATP，而 PNK 在其中具有活性。

連接反應 放在冰上。

6.7 μL 無核酸酶水 (Catalog No. W4502)
2 μL PNK Reaction (from step 5)
0.8 μL 10x T4 DNA Ligase buffer
0.5 μL T4 DNA Ligase

在 16 °C 下孵育過夜或在室溫下孵育 2 小時。

步驟 6：轉換成合格的 E. coli。大腸桿菌

步驟 7：透過 DNA 測序確認突變

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