磷酸鈣轉染試劑盒協議

引言

磷酸鈣轉染是一種常用於將 DNA 導入真核細胞的方法。這項技術已被用來在各種類型的細胞中獲得瞬間¹ 和穩定的² 轉染。此程序是將含磷酸鈉的 HEPES 緩衝生理鹽水與含 DNA 的 CaCl₂ solution 慢速混合。DNA 與磷酸鈣形成共沉澱物，附著在細胞表面，並被細胞吸收，推測是透過內吞作用。

提供的試劑

磷酸鈣轉染試劑盒（產品編號 CAPHOS）中提供的試劑經由 0.2 µM 過濾器消毒，並經無菌灌裝。該試劑盒可以：

• 在 10 cm 皿上轉染 80 次
• 或在 6 cm 皿上轉染 160 次（約 25 X 6 孔板）
• 或在 3.5 cm 皿（約 36 X 12 孔板）

磷酸鈣轉染試劑盒（產品編號 CAPHOS）包含以下內容：

• 1小瓶 2.5M CaCl₂ （產品編號 C2052）
• 1小瓶（25 mL）分子生物學級水（產品編號. W4502)
• 1 瓶 (25 mL) 2x HEPES Buffered Saline, pH 7.05 (Product No.  H1012)
  50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HPO₄

儲存

將所有元件儲存於 -20 °C 。

程序

以下程序設計用於用 1 µg/µL pSV40-CAT 質粒（稀釋在無菌分子生物學級水中）轉染 CHO 細胞。將細胞培養在適合細胞類型的標準含血清或無血清培養基。不建議使用抗生素。使用良好的無菌技術，並僅使用無菌材料。

DNA質粒應為高品質、經乙醇沉澱、重懸於分子生物學級水中的質粒，最終濃度為1 µg/µL。

本方案可進行優化，以用於各種類型的細胞。

第一天：平板細胞

按照以下圖表平板細胞：

Culture Dish	3.5 cm 皿	2 x 105
3.tr>	5 x 105<
1 - 2 x 106

第二天：轉染

1. 準備轉染細胞時，根據下圖加入新鮮的完全培養基：

Culture Dish	3.5 cm 皿	1
2
4

2.兩小時後，準備兩管轉染試劑，如下所示：

培養皿	中管 B
		CaCl2 (µL)	H2O (µL)	DNA (µL)<	HeBS (µL)
3.5 cm平皿	6	49<	5	60
15	123	12	150
30	245	25	300

3.使用連接 1 mL 血清移液管的自動移液泵，以 200 uL 移液管吸頭，使 HeBS（B 管）產生氣泡。

4.在 HeBS（B 管）產生氣泡的同時，滴加 A 管（來自步驟 2）的內容物。渦旋 2 - 4 秒。

6.讓沉澱物不受干擾地放置 20 分鐘。將溶液均勻滴在平板上的細胞培養基上。輕輕攪動平板，使沉澱物均勻地分布在平板上的細胞上。培養細胞過夜（約 16 小時）。

第三天：可選的甘油震盪

1. 在離心管中混合以下物質：

50%無菌甘油（μL)	2x HeBS (µL)	HH2O (µL)
3.5 cm 皿	100	250	150
225	565<	335
450	1130	670

2.從培養皿中移除培養基，換上甘油溶液。孵育 2 分鐘。

3. 移除甘油溶液，用 PBS 洗兩次：

4.

Culture Dish	3.5 cm 皿	2
6.5
10

第三天：更換培養基

1. 過夜培養（或選擇性甘油震盪）後，吸出培養基（或 PBS）並換成完整的培養基。
2. 孵育細胞 48 小時。
3. 收集並裂解細胞 - 它們可以用於其他應用。

參考資料

1. Graham F, van der Eb A. 1973. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52(2):456-467. https://doi.org/10.1016/0042-6822(73)90341-3

2. Wigler M, Pellicer A, Silverstein S, Axel R. 1978. Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell. 14(3):725-731. https://doi.org/10.1016/0092-8674(78)90254-4