有效細胞協議

引言

轉化是某些細菌從環境中吸收外來遺傳物質（裸 DNA）的過程。一旦進入細胞質，如果遺傳物質與細菌 DNA 不同，就可能會被核酸酶降解。如果外源遺傳物質與細菌 DNA 相似，則可能會整合到染色體中。

不是所有的細菌都能夠從環境中吸收外源 DNA。  細菌要吸收 DNA，必須要有能力。細菌可以是天然有能力的，也可以用人工方法使其有能力。調節自然能力的因素在不同菌屬之間有所不同。獲取能力細胞的實際方法是使用化學品或電脈衝使細菌細胞具有人工能力。

• 能力的化學誘導包括以下步驟：
  • 在磷酸鈣（目錄編號：Catalog No.Note: To endure the heat shock treatment, it is important the cells used are in the log phase of growth.
    • 另一種方法是將細菌細胞置於電脈衝下，使其具有通透性，此過程稱為「電穿孔」（electroporation）。細菌可作為宿主細胞來製造 DNA 副本、進行克隆、表達大量蛋白質、生成 cDNA 文庫，以及用於 DNA 連接研究，因為它們很容易大量生長。
      

      我們的目錄中提供的有效細胞

      我們提供一系列的& Escherichia coli bacterial cells made competent with the highest efficiencies by optimized procedure specific to each strain.從 24個新的competent cells 中選擇，以滿足蛋白質表達、常規或疑難克隆以及文庫生成等多種應用。提供許多試用尺寸！
      

      程序

      開始轉換前的注意事項：

      • 準備 LB 瓊脂平板並讓其凝膠化。
      • 根據質粒 DNA 中的抗生素標記，在 LB 瓊脂中加入適當的抗生素。
      • 如果需要對重組子進行藍/白色篩選，則在 LB 瓊脂中加入 1mM IPTG、300µg/ml S-Gal 或 40µg/ml X-Gal 和 500µg/ml 檸檬酸鐵銨。
      • 如果使用電泳細胞，將電穿孔室置於冰上。
      • 將水浴加熱至 37 °C。
      • 將無菌 SOC 培基加熱至室溫（或在水浴中加熱至 20-25 °C）。

      使用化學合格細胞進行轉化的步驟

      需要但未提供的材料：

	試劑試劑	設備
Catalog No.L7533)	櫥櫃培養箱 (37 °C)
適當選擇抗生素	加熱水浴 (37 °C)
目錄編號.I6758)	15ml聚丙烯培養管（無菌）
X-gal（目錄編號。B9146)	培養皿
S-Gal (Catalog No.S9811)	Lazy-L無菌擴展器 (目錄編號.Z376779)
目錄編號.F5879)

標準轉換步驟：

1. 將所需數量的試管從 -70 °C 冷凍庫移到濕冰上。如果需要，再加一管對照 DNA。
2. 讓細胞解凍 5 分鐘。輕輕拍打試管多次，以獲得均勻的懸浮液。
3. 將 1-50ng 已純化的質粒 DNA 直接加入其餘試管中的細胞。
   註： 對照用：在一管中加入 1µL (10ng) pUC19 對照 DNA。
4. 在冰上孵育細胞 30 分鐘。
5. 將細胞轉移到 37 °C 水浴中正好 45 秒。
6. 將細胞轉移到冰上 2 分鐘。
7. 將細胞轉移到無菌聚丙烯管中，鬆開管蓋，使培養物通氣。
8. 將細胞放在搖床培養箱（225-250 rpm）中，37 °C，培養 1 小時。
9. 用移液管吸取10-100µL的每個轉化細胞懸浮液到含有選擇抗生素的LB瓊脂平板上，然後用無菌擴展器擴展。
10. 在 37 °C 下培養平板過夜。
11. 根據需要選擇菌落（colony）並進行培養。
12. 從每個培養物中分離出質粒 DNA。
13. 使用限制性酵素消化質粒 DNA；以凝膠電泳分離。
14. 培養優選的克隆。

使用 Electrocompetent cells 進行轉換的步驟

需要但未提供的材料：

	試劑試劑	設備
Catalog No.S1797)	搖床培養箱 (37 °C)
目錄編號.L7533)	櫥櫃培養箱 (37 °C)
適當選擇抗生素	電泳槽和比色皿
IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）	15ml聚丙烯培養管（無菌）
(目錄 編號.I6758)
X-gal(目錄 編號.B9146)	1.5ml聚丙烯微量移液管（無菌）
S-Gal™ (Catalog No.S9811)	Lazy-L無菌撒布器 (型錄 No.Z376779)
Catalog No.F5879)	培養皿

標準轉換步驟：

1. 將所需數量的試管從 -70 °C 冷凍庫移到濕冰上。如果需要，再加一管對照 DNA。
2. 讓細胞解凍 5 分鐘。
3. 將 SOC 培養基移入培養管中，每個轉換反應用一個培養管，室溫放置。
4. 將1mm標準比色皿和無菌微離心管放在冰上，每個轉換反應放置一個。使用80µL包裝中的40µL細胞和100µL包裝中的50µL細胞。
5. 在TE緩衝液中準備5倍稀釋的DNA或結合混合物。
   註：對照用：
6. 用移液管將DNA和細胞的混合物移入冷凍的1mm比色皿中。
7. 將電孔器設置為25kV/cm的場強度，持續6ms，並處理細胞。
8. 從比色皿中取出細胞，加入含有SOC培養基的試管中。
9. 在37 °C的振荡培养箱（225-250rpm）中培养细胞1小时。
10. 用移液管取10-100µL的转化细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂平板上，并用无菌铺展器铺展。
11. 根據需要選擇一個菌落並進行培養。
12. 從每個培養物中分離出質粒 DNA。
13. 使用限制性酵素消化質粒 DNA 並用凝膠電泳分離。
14. 培養優選的克隆。

優化轉換過程的重要提示：

• 收到細胞時，確認細胞仍然冷凍，乾冰仍然存在。
• 為了獲得最高的轉換效率，請使用不含酚、乙醇、蛋白質、鹽或洗滌劑的高品質 DNA 樣本。使用電泳細胞時，DNA 中鹽分含量高會導致高電壓下產生電弧，可能會損壞樣品和設備。
• 含有高品質試劑的結合反應中的 DNA 可用於轉換。DNA 結合酶不需要失活。
• 任何時候都要將合格細胞保持在冰上；防止細胞意外升溫。
• 輕輕拍打試管以獲得均勻的細胞懸浮液。
• 將 LB 瓊脂平板溫度升至 37 °C，以獲得最佳的菌落生長。
• 使用電動能力細胞進行轉換時的電離室設定：
  • BTX ECM 630 型：HV模式，2.5kV，25µF，100Ω，1mm比色皿
  • BioRad Gene Pulser：2.5kV，25µF，100Ω，1mm比色皿

參考資料

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. [Internet]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu. Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994