Test enzymatyczny litykazy

Opis

Ta procedura może być stosowana do oznaczania aktywności litykazy przy użyciu drożdży Bakera jako substratu. Oznaczanie szybkości turbidymetrycznej [Absorbancja przy 800 nm (A₈₀₀), Droga światła = 1 cm] opiera się na następującej reakcji:

Definicja jednostki: Jedna jednostka litykazy wytworzy ΔA₈₀₀ równe 0,001 na minutę przy pH 7,5 w temperaturze 25 °C, przy użyciu zawiesiny drożdży jako substratu w 3 ml mieszaniny reakcyjnej.

Wymagane odczynniki i sprzęt

• 1 M roztwór jednozasadowego fosforanu potasu (numer katalogowy P8709)
• 1 M dwuzasadowy roztwór fosforanu potasu (numer katalogowy P8584)
• Drożdże z Saccharomyces cerevisiae (numer katalogowy YSC1)

Środki ostrożności - Informacje dotyczące zagrożeń i bezpiecznego obchodzenia się z produktem znajdują się w karcie charakterystyki.

Instrukcje przygotowania

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (oporność ≥18 MΩxcm w temperaturze 25 °C).

Bufor fosforanowy (67 mM bufor fosforanu potasu, pH 7.5, w 25 °C) - Aby przygotować 100 ml:

1. Odmierzyć pipetą 1,33 ml 1 M jednozasadowego roztworu fosforanu potasu (numer katalogowy P8709) do odpowiedniej zlewki.
2. Dodać 5.37 ml 1 M dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu (numer katalogowy P8584).
3. Rozcieńczyć do 100 ml ultraczystą wodą.
4. Dostosować do pH 7,5 za pomocą 1 M KOH.

Podłoże [0.4% (w/v) zawiesina drożdży piekarskich (drożdże z Saccharomyces cerevisiae)] -

1. Używając moździerza i tłuczka zmielić odpowiednią ilość drożdży (numer katalogowy YSC1), aby uzyskać więcej niż 800 mg proszku. Zmielony proszek powinien mieć rozmiar oczek 25-30.

2. Używając proszku, przygotuj zawiesinę drożdży 4 mg / ml w ultraczystej wodzie.

3. Wymieszaj roztwór z prędkością, przy której powstaje minimalny wir. Mieszać przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Mieszanie z większą prędkością może spowodować przedwczesną lizę komórek drożdży.

4. Po 1 godzinie zaprzestać mieszania, aby umożliwić osadzenie się większych osadów przez 30 minut. Ostrożnie zdekantuj górne dwie trzecie supernatantu do nowej zlewki. Usunięcie większych osadów zminimalizuje ilość szumów widocznych w odczytach spektrofotometru podczas wykonywania testu.

5. Stężenie substratu musi zostać zweryfikowane przed wykonaniem testu.

   a. Odmierzyć pipetą następujące odczynniki do odpowiednich kuwet:

Odczynnik	Puste miejsce (mL)	Substrat (mL)
Woda ultraczysta	1.50	0.60
Bufor fosforanowy	1.50	1.50
Substrat, krok 4	-	0.90

   b. Zmierz A₈₀₀ mieszaniny drożdży względem ultraczystej wody. ΔA₈₀₀ [ΔA_{800(Substrat)} = A_{800(Substrat)} - A_800(Blank)]musi wynosić między 0,7 -1,0. W razie potrzeby dostosuj absorbancję za pomocą odpowiedniej ilości proszku drożdżowego lub ultraczystej wody.

6. Powoli mieszaj substrat (z minimalnym worteksem) w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania testu. Jest stabilny do 8 godzin.

Roztwór enzymu - Przygotuj 10 mg stałego/ml roztworu litykazy. Bezpośrednio przed użyciem, przygotuj wtórne rozcieńczenie tak, aby skorygowane ΔA₈₀₀/min mieściło się w zakresie od 0,025 do 0,035. Jeśli szybkość wykracza poza ten zakres, należy dokonać odpowiedniej korekty wtórnego rozcieńczenia i powtórzyć.

Uwagi:

• W przypadku niektórych surowych produktów litykazy przejście do roztworu może zająć więcej niż 15 minut. Krótkie okresy sonikacji 1-15 sekund mogą pomóc w rozpuszczeniu enzymu bez wpływu na aktywność enzymatyczną.

• Jeśli skorygowana absorbancja jest mniejsza niż 0.025, enzym należy bardziej stężony, aby osiągnąć skorygowaną absorbancję między 0,025-0,035.

• Jeśli skorygowana absorbancja jest większa niż 0.035, enzym powinien być mniej stężony , aby osiągnąć skorygowaną absorbancję pomiędzy 0.025-0.035.

Procedura

W 3.00 ml mieszaniny reakcyjnej, końcowe stężenia wynoszą 34 mM fosforanu potasu, ~0,12% (w/v) drożdży piekarskich i 25-35 jednostek litykazy.

1. Pipetuj następujące odczynniki do odpowiednich pojemników:

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)	Puste (mL)
Woda ultraczysta	0.55	0.55	0.55	0.60
Bufor fosforanowy	1.50	1.50	1.50	1.50
Substrat	0.90	0.90	0.90	0.90

2. Wymieszać kuwety testowe i kuwety ze ślepą próbą przez odwrócenie i wyrównać do 25 °C. Następnie dodać roztwór enzymu:

.

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Puste (mL)
Roztwór enzymu	0.	Test 3 (mL)	Puste (mL)
Roztwór enzymu	0.050	0,050	0,050	-

3. Natychmiast wymieszaj próbę ślepą i wszystkie testy przez odwrócenie. Wykonaj to sekwencyjnie, aby uchwycić efekty osiadania substratu. Rejestruj spadek absorbancji przy A₈₀₀ przez ~10 minut

4. Używając 2-minutowego okresu czasu, uzyskaj ΔA₈₀₀/min przy użyciu maksymalnej szybkości liniowej dla każdego testu. Każda szybkość testu musi być skorygowana przy użyciu odpowiednich ram czasowych dla ślepej próby.

5. Skorygowana ΔA₈₀₀/min musi mieścić się między 0,025 a 0,035, aby test był ważny. Jeśli szybkość wykracza poza ten zakres, należy dokonać odpowiednich korekt stężenia enzymu i powtórzyć test.

Wyniki

Obliczenia

1.

.

gdzie:
df = współczynnik rozcieńczenia enzymu
0,001 = zmiana absorbancji przy 800 nm zgodnie z definicją jednostki
0,050 = objętość (mL) roztworu enzymu użytego w reakcji

2.

2.