Test enzymatyczny α-amylazy (EC 3.2.1.1)

Przegląd: Oznaczanie aktywności alfa-amylazy

Tę procedurę można stosować do oznaczania aktywności α-amylazy.

Spektrofotometryczne oznaczanie reakcji zatrzymania (A₅₄₀, droga światła = 1 cm) opiera się na następującej reakcji:

Definicja jednostki: Jedna jednostka uwalnia 1,0 mg maltozy ze skrobi w ciągu 3 minut przy pH 6,9 i temperaturze 20 °C.

Wymagane odczynniki i sprzęt

Fosforan sodu, jednozasadowy, numer produktu S0751

Chlorek sodu, numer produktu S9888

Skrobia ziemniaczana, numer produktu S2004

Wodorotlenek sodu, numer produktu S5881<

Winian sodowo-potasowy, tetrahydrat, numer produktu S2377.

Kwas 3,5-dinitrosalicylowy, numer produktu D0550

D-(+)-Maltoza, monohydrat, numer produktu M9171

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego postępowania należy zapoznać się z kartą charakterystyki.

Instrukcje przygotowania

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (oporność ≥18 MΩ×cm w 25 °C).

Roztwór buforowy (20 mM fosforan sodu z 6.7 mM chlorku sodu, pH 6,9 w temperaturze 20 °C) - Przygotuj roztwór zawierający 2,4 mg/ml jednozasadowego fosforanu sodu o numerze produktu S0751 i 0,39 mg/ml chlorku sodu.39 mg/ml chlorku sodu, numer produktu S9888, w ultraczystej wodzie.  Dostosuj do pH 6,9 w 20 °C przy użyciu 1 M NaOH/1 M HCl.

Roztwór skrobi [1.0% (w/v) Rozpuszczalny roztwór skrobi] - Przygotuj roztwór o stężeniu 10 mg/ml używając skrobi ziemniaczanej, numer produktu S2004, w buforze:

• Roztwór rozpuścić przez gotowanie na płytce grzewczej/mieszanie przez 15 minut z mieszaniem.
• Zdjąć z ognia. Kontynuuj mieszanie roztworu i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
• Doprowadź roztwór do końcowej objętości za pomocą ultraczystej wody.
• Kontynuuj mieszanie roztworu podczas całej procedury testu.

2 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) - Przygotuj roztwór o stężeniu 80 mg/mL przy użyciu wodorotlenku sodu, numer produktu S5881, w ultraczystej wodzie.

5.3 M roztwór winianu sodowo-potasowego, tetrahydrat - Przygotować 1,496 mg/ml roztwór winianu sodowo-potasowego, tetrahydrat, numer produktu S2377, w 2 M roztworze wodorotlenku sodu (NaOH).Nie podgrzewać do wrzenia!

96 mM roztwór kwasu 3,5-dinitrosalicylowego - Przygotować roztwór o stężeniu 21.9 mg/ml roztworu przy użyciu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego, numer produktu D0550, w ultraczystej wodzie.  Rozpuścić substancje stałe przez ogrzewanie na płytce grzejnej/mieszanie. Nie podgrzewać do wrzenia!

Roztwór odczynnika barwnego - Do przygotowania 40 ml,  dodaj:

• 12.0 ml ciepłej (50-70 °C) ultraczystej wody do odpowiedniej wielkości bursztynowej butelki.
  Mieszając, powoli dodaj:
• 8,0 ml ciepłego 5.3 M tetrahydratu winianu sodowo-potasowego
• 20 mL ciepłego 96 mM roztworu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego

Roztwór jest stabilny przez 6 miesięcy w temperaturze otoczenia, jeśli jest chroniony przed światłem. Przygotowana objętość może być dostosowana w razie potrzeby.

0,2% (w/v) Maltose Standard - Przygotuj roztwór 2 mg / ml w kolbie miarowej przy użyciu monohydratu D-(+)-maltozy, numer produktu M9171, w ultraczystej wodzie.

α-Amylaza Roztwór próbki - Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 0.75-1,5 jednostek/ml α-amylazy w wodzie ultraczystej o temperaturze 20 °C.

Procedura

Ostateczne stężenie testu - W 2.00 ml objętości reakcyjnej, końcowe stężenie wynosi 0,50% (w/v) skrobi i ~1 jednostka α-amylazy.

1. Test próbki α-amylazy

a. Odmierzyć pipetą (w ml) następujące odczynniki do odpowiednich pojemników:

Odczynnik	Próbka 1	Próbka 2	Próbka 3	Próbka pusta
Roztwór skrobi	1.00	1.00	1.00	1.00

b. Wymieszać przez wirowanie i wyrównać do 20 °C.  Następnie dodać (w ml):

Odczynnik	Próbka 1	Próbka 2	Próbka 3	Próbka pusta
α-Amylaza Próbka	0.50	0.70	1.00	-

c. Wymieszać przez wirowanie i inkubować przez dokładnie  3,0 minuty w temperaturze 20 °C.  Następnie dodać:

Reagent	Sample 1	Sample 2	Próbka 3	Próbka pusta
Kolor odczynnika	1.00	1.00	1.00	1.00

d. Przykryć pojemniki wentylowaną pokrywką i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na dokładnie 15 minut.

e. Wyjmij pojemniki z wrzącej łaźni wodnej. Następnie dodać (w ml):

e.

Odczynnik	Próbka 1	Próbka 2	Próbka 3	Próbka pusta
α-Amylaza Próbka	0.50	0.30	-	1.00

f. Schłodzić roztwory na lodzie do temperatury pokojowej.

g. Następnie dodać (w ml):

Odczynnik	Próbka 1	Próbka 2	Próbka 3	Próbka ślepa
Woda ultraczysta	9.00	9.00	9.00	9.00

h. Wymieszać przez odwrócenie. Wyzerować odpowiedni spektrofotometr względem powietrza przy długości fali 540 nm i zapisać wartość A₅₄₀ dla Próbki i Próbki ślepej.

2. Przygotowanie krzywej wzorcowej

a. Przygotuj krzywą standardową, pipetując (w mL) następujące odczynniki do odpowiednich pojemników:

Reagent	STD1	STD2	STD3	STD4	STD5	STD6	STD7	STD BLK
0.2% (w/v) Maltose Standard	0.05	0.20	0.40	0.60	0.80	1.00	2.00	-
Woda ultraczysta	1.95	1.80	1.60	1.40	1.20	1.00	-	2.00
Color Reagent	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00

Uwaga: W razie potrzeby można dodać dodatkowe standardowe poziomy.

b. Przykryj pojemniki wentylowaną pokrywką i umieść we wrzącej łaźni wodnej na dokładnie 15 minut.

c. Wyjąć pojemniki z wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić roztwory na lodzie do temperatury pokojowej.

d. Następnie dodać (w ml):

Reagent	STD1	STD2	STD3	STD4	STD5	STD6	STD7	STD BLK
Woda ultraczysta	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00

e. Wymieszać przez odwrócenie. Zaślepić odpowiedni spektrofotometr względem powietrza przy długości fali 540 nm i zanotować wartość A₅₄₀ dla Standardów i Standardowej ślepej próby.

Wyniki

Obliczenia

1. Określ ΔA₅₄₀ każdego Standardu vs.  Standard Blank.
   ΔA_{540 (Standard)} = A_{540 (Standard)} - A_{540 (Standard Blank)}
2. Przygotuj krzywą wzorcową, wykreślając ΔA₅₄₀ wzorców vs. mg maltozy przy użyciu regresji liniowej. mg maltozy przy użyciu regresji liniowej.
3. Określić ΔA₅₄₀ każdej Próbki vs. Próbki ślepej.
   ΔA_{540 (Próbka)} = A_{540 (Próbka)}&A_{540 (próbka ślepa)}
4. Określić mg uwolnionej maltozy przy użyciu krzywej standardowej.
   
   
5.   

.

gdzie:
df = współczynnik rozcieńczenia
mL enzymu  = mL próbki dodanej w kroku 1b.

6.

6.

Odniesienie

1. Bernfeld P. 1955. [17] Amylases, ? and ?.149-158. https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5