Procedura testu dla lipazy

Zasada

Pojawienie się barwnika chinoneiminy jest mierzone przy 545 nm za pomocą spektrofotometrii.

Definicja jednostki

Jedna jednostka powoduje powstawanie jednego mikromola glicerolu (pół mikromola barwnika chinoneiminy) na minutę w warunkach opisanych poniżej.

Metoda

Odczynniki

A. Emulsja z oliwy z oliwek	：Sonikować mieszaninę 5,0 g oliwy z oliwek ［klasy odczynnikowej (wysokorafinowana, o niskiej kwasowości)］ i 5,0 ml 5,0% roztworu Triton X-100 (B) przez 10 minut (20 kHz). Do emulsji olejowej dodać 25 ml 4,0% roztworu BSA (C) i 15 ml 0,1 M buforu K-fosforanowego, pH 7,0 (D) i wymieszać. (Powinien być przygotowany na świeżo)
B. Roztwór Triton X-100	：5,0% (5,0 ml detergentu Triton X-100/100 ml H2O)
C. Roztwór BSA	：4,0%［4,0 g albuminy surowicy bydlęcej/100 mL H2O］
D. Bufor K-fosforanowy, pH 7,0	：0,1 M
E.Roztwór TCA	：0,2 M (33 g kwasu trichlorooctowego/1,000 mL H2O)
F. Bufor MES-NaOH	：50 mM bufor MES, pH 6,5［Rozpuścić 9,76 g kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MW＝195.23) w ok. 850 mL HO. 850 ml H2O i, po dostosowaniu pH do 6,5 za pomocą 5,0 N NaOH, dopełnić do 1000 ml H2O］
G. Odczynnik do wywoływania barw	：Rozpuścić następujące substancje chemiczne i enzymy w 200 mL 50 mM buforu MES (F) w następującej kolejności:
4.0 mL 0,04 mL 4,0 mg 24,2 mg 40.7 mg 200 jednostek 500 jednostek 300 jednostek	Roztwór Triton X-100 (B) N,N-dietylo-m-toluidyna (mieszać do całkowitego rozpuszczenia) 4-aminoantypiryna ATP・Na2・3H2O MgCl2・6H2O Kinaza glicerolowa Oksydaza L-α-glicerofosforanowa Peroksydaza (jednostki purpurogaliny)
	(Stabilny przez tydzień, jeśli przechowywany w temperaturze 4 ℃ w bursztynowej butelce)
H. Rozcieńczalnik enzymu	：20 mM bufor K-fosforanowy, pH 7.5 zawierający 2.0 mM MgCl2 i 0,5 mM EDTA-Na3

Procedura

(1. krok)

1. Nanieść pipetą 2,0 ml emulsji oliwy z oliwek (A) do probówki i wyrównać w temperaturze 37 ℃ przez około 5 minut.

.

Stężenie w mieszaninie testowej
Bufor K-fosforanowy	29.1 mM
Oliwa z oliwek	90.9 mg/ml
MgCl2	0,18 mM
Triton X-100	9.1 %
EDTA	45 μM
BSA	1.8 %

2. Dodaj 0,2 ml roztworu enzymu* i wymieszaj.
3. Po dokładnie 15 minutach w temperaturze 37 ℃, dodaj 2,0 ml roztworu TCA (E), aby zatrzymać reakcję i usuń osad przez filtrację przez bibułę filtracyjną (Toyo-Roshi nr 131 lub Whatman nr 42).
   

(2. krok)

4. Pipetą pobrać 0,05 ml przesączu.05 ml tak otrzymanego filtratu do probówki.
5. Dodaj 3,0 ml odczynnika wywołującego kolor (G) i inkubuj w temperaturze 37 ℃ przez 15 minut.
   
6. Pomiar gęstości optycznej przy 545 nm względem wody (test OD).
   

W tym samym czasie przygotuj próbę ślepą, najpierw mieszając 2.0 ml emulsji oliwy z oliwek (A) po 15 minutach inkubacji w temperaturze 37 ℃ z 2,0 ml roztworu TCA, a następnie dodanie roztworu enzymu (pierwszy krok). Używając przesączu uzyskanego z mieszaniny, przeprowadzić drugi etap, stosując tę samą procedurę co w teście i zmierzyć gęstość optyczną przy 545 nm (OD blank).

* Rozpuścić preparat enzymatyczny w lodowatym rozcieńczalniku enzymatycznym (H) i rozcieńczyć do 0.4-1,2 U/ml tym samym buforem, bezpośrednio przed testem.

Obliczenia

Aktywność można obliczyć za pomocą następującego wzoru：

Aktywność wagowa (U/mg)＝(U/mL)×1/C

Vt-1	：Całkowita objętość w 1. kroku (4.2 mL)
Vt-2	：Całkowita objętość w 2. kroku (3.05 mL)
Vs-1	：Objętość próbki (0.2 mL)
Vs-2	：Objętość próbki w 2. kroku (0,05 mL)
28.2	：Milimolarny współczynnik ekstynkcji barwnika chinoniminowego w warunkach testu (F/mikromol)
1/2	：Współczynnik oparty na fakcie, że jeden mol H2O2 wytwarza pół mola barwnika chinoneiminy
1.0	：Długość ścieżki światła (cm)
t	：Czas reakcji w pierwszym etapie (15 minut)
df	：Współczynnik rozcieńczenia
C	：Stężenie enzymu w roztworze (c mg/ml)

Ta procedura ma charakter informacyjny.