Procedura testu dla proteazy

Zasada

Pojawienie się peptydów jest mierzone jako ekwiwalent tyrozyny przy 275 nm za pomocą spektrofotometrii.

Definicja jednostki

Jedna jednostka powoduje wzrost gęstości optycznej przy 275 nm odpowiadający jednemu mikromolowi tyrozyny na minutę w warunkach opisanych poniżej.

Metoda

Odczynniki

.

A. Roztwór kazeiny (0,6%)	：Zawiesić 3,0 g kazeiny mleka Hammersten w 20 ml 0,1 N roztworu NaOH i rozpuścić przez ogrzewanie w łaźni wodnej (60 ℃). Schłodzić do temperatury pokojowej, dodać 50 ml 0,1 M boraksu i 400 ml H2O i po dostosowaniu pH do 11,0 za pomocą 1.0 N NaOH, uzupełnić do 500 ml H2O］ (stabilny przez tydzień przechowywany w temperaturze 0-5 ℃)
B. Mieszanina TCA	：0.11 M kwas trójchlorooctowy (TCA) zawierający 0.22 M octan sodu i 0.33 M kwas octowy
C. Rozcieńczalnik enzymu	：2.0 mM octanu wapnia

Procedura

1. Zanieść pipetą 3,0 ml roztworu substratu (A) do probówki testowej i wyrównać w temperaturze 30 ℃ przez 5 minut.

.

Stężenie w mieszaninie testowej
Borax	8.6 mM
Kazyna	5.1 mg/ml
Ca(CH3COO)2	0.29 mM

2. Dodaj 0,5 ml roztworu enzymu* i wymieszaj.
   
3. Po dokładnie 10 minutach w temperaturze 30 ℃ dodaj 3,2 ml mieszaniny TCA (B), aby zatrzymać reakcję.
   
4. Inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 30 ℃.
   
5. Przefiltrować mieszaninę bibułą filtracyjną (Toyo Roshi No.131) i zmierzyć gęstość optyczną przesączu przy 275 nm (test OD).
   

W tym samym czasie przygotować ślepą próbę, najpierw mieszając roztwór substratu z 3,2 ml mieszaniny TCA (B) po 10 minutach inkubacji w temperaturze 30 ℃, a następnie dodając roztwór enzymu i przeprowadzić tę samą procedurę (procedura 4-5) w teście (ślepa próba OD).

* Rozpuścić preparat enzymatyczny w lodowatym 10 mM buforze boraksowo-naftowym, pH 11,0 i rozcieńczyć do 0,1-0.4U/ml rozcieńczalnikiem enzymatycznym (C), bezpośrednio przed testem.

Obliczenia

Aktywność można obliczyć za pomocą następującego wzoru：

Aktywność wagowa (U/mg)＝(U/mL)×1/C

Vt	：Objętość całkowita (6.7 mL)
Vs	：Objętość próbki (0.5 mL)
1.34	：Milimolarny współczynnik ekstynkcji tyrozyny (F/mikromol)
1.0	：Długość ścieżki światła (cm)
t	：Czas reakcji (10 minut)
df	：Współczynnik rozcieńczenia
C	：Stężenie enzymu w roztworze (c mg/mL)

Ta procedura ma charakter informacyjny.