Enzymatyczna metoda oznaczania alaniny (test alaninowy)
Ten protokół testu jest odpowiedni do kolorymetrycznego/fluorometrycznego wykrywania alaniny w supernatantach hodowli komórkowych i tkankowych, moczu, osoczu, surowicy i innych próbkach biologicznych przy użyciu zestawu do oznaczania alaniny (MAK001). Stężenie alaniny jest określane za pomocą sprzężonego testu enzymatycznego, który daje kolorymetryczny (570 nm)/fluorometryczny (λex = 535/λem = 587 nm) produkt, proporcjonalny do obecnej alaniny. Typowe zakresy wykrywania dla tego zestawu to 2-10 nmoli (kolorymetryczny) i 0,2-1 nmoli (fluorometryczny).
Przegląd sekcji
Środki ostrożności i zastrzeżenia
Ten produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku badawczo-rozwojowego, a nie do celów farmaceutycznych, domowych lub innych. Należy zapoznać się z kartą charakterystyki w celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego obchodzenia się z produktem.
Odczynniki
- 25 mL buforu do oznaczania alaniny
- 0.2 mL sondy alaninowej w DMSO
- 1 vl enzymu konwertującego alaninę
- 1 vl Alanine Development Mix
- 1 vl Alanine Standard, 10 µmole
Odczynniki i sprzęt wymagane, ale niedostarczone
- 96-dołkowa płytka z płaskim dnem - Zaleca się stosowanie czarnych płytek z przezroczystym dnem (M5686 lub równoważnych) do testów fluorescencyjnych i przezroczystych płytek (M4436 lub równoważnych) do testów kolorymetrycznych.
- Fluorescencyjny lub spektrofotometryczny czytnik płytek wielodołkowych
- 10 kDa Molecular Weight Cut-Off (MWCO) Spin Filter (.Z706345 lub równoważny)
Instrukcje przygotowania
Krótko odwirować fiolki przed otwarciem. Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody. Aby zachować integralność odczynników, należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
Alanine Assay Buffer - Przed użyciem pozostawić bufor do osiągnięcia temperatury pokojowej.
Alanine Probe - Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej w celu stopienia zamrożonego roztworu. Przechowywać z dala od światła i wilgoci w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu sonda alaninowa jest gotowa do użycia w teście kolorymetrycznym.
Dla testu fluorescencyjnego, rozcieńczyć porcję roztworu kolorymetrycznej sondy alaninowej od 5 do 10 razy buforem do oznaczania alaniny, tuż przed użyciem.
Enzym konwertujący alaninę - rozpuścić w 220 µl buforu do oznaczania alaniny. Dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie podzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przechowywać w chłodnym miejscu i chronić przed światłem. Zużyć w ciągu 2 miesięcy od odtworzenia.
Alanine Development Mix - odtworzyć w 220 µL buforu do oznaczania alaniny. Dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie podzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zużyć w ciągu 2 miesięcy od rekonstytucji.
Alanine Standard - Rozpuścić w 100 µL wody, aby uzyskać 100 mM (100 nmoli/µL) roztwór wzorcowy alaniny. Dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie podzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Storage/Stability
Zestaw jest dostarczany w mokrym lodzie. Zaleca się przechowywanie w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.
Procedura
Wszystkie próbki i wzorce powinny być wykonywane w dwóch egzemplarzach.
Wzorce alaniny do wykrywania kolorymetrycznego
Rozcieńczyć 10 µL roztworu wzorcowego alaniny o stężeniu 100 mM (100 nmoli/µL) za pomocą 990 µL wody, aby przygotować roztwór wzorcowy o stężeniu 1 mM (1 nmol/µL). Dodaj 0, 2, 4, 6, 8, 10 µL roztworu wzorcowego alaniny o stężeniu 1 mM do 96-dołkowej płytki, uzyskując 0 (ślepa próba), 2, 4, 6, 8 i 10 nmoli/basenik. Dodaj bufor testowy alaniny do każdej studzienki, aby zwiększyć objętość do 50 µl.
Wykrywanie fluorometryczne wzorców alaniny
Przygotuj roztwór wzorcowy o stężeniu 1 mM, tak jak w przypadku testu kolorymetrycznego. Pobrać 100 µL roztworu wzorcowego alaniny o stężeniu 1 mM i dodać do 900 µL wody, aby uzyskać roztwór wzorcowy alaniny o stężeniu 0,1 mM. Dodaj 0, 2, 4, 6, 8, 10 µL roztworu wzorcowego alaniny o stężeniu 0,1 mM do 96-dołkowej płytki, uzyskując wzorce 0 (ślepa próba), 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1,0 nmol/dołek.
Przygotowanie próbki
Zarówno testy kolorymetryczne, jak i fluorometryczne wymagają 50 µL próbki na każdą reakcję (studzienkę).
Próbki surowicy należy zdeproteinizować przed użyciem w teście za pomocą filtra wirówkowego 10 kDa MWCO. 10-50 µL zdeproteinizowanych próbek surowicy można bezpośrednio rozcieńczyć do końcowej objętości 50 µL buforem do oznaczania alaniny.
Tkanki lub komórki (1 x 106) można homogenizować w 100 µL buforu do oznaczania alaniny. Wirować próbki z prędkością 13 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Doprowadź próbki do końcowej objętości 50 µl za pomocą buforu do oznaczania alaniny.
Uwagi: Próbki inne niż surowica mogą być również deproteinizowane za pomocą filtra wirówkowego 10 kDa MWCO przed dodaniem do reakcji.
W przypadku nieznanych próbek zaleca się przetestowanie kilku rozcieńczeń próbki, aby upewnić się, że odczyty mieszczą się w zakresie liniowym krzywej standardowej.
Dołącz próbkę ślepą dla każdej próbki, pomijając enzym konwertujący alaninę w mieszaninie reakcyjnej.
Reakcja testowa
- Ustaw mieszaniny reakcyjne zgodnie ze schematem w poniższej tabeli. Dla każdej reakcji (studzienki) wymagane jest 50 µL odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej.
- Dodaj 50 µL odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki ślepej, standardowej i testowej. Dobrze wymieszaj za pomocą wytrząsarki poziomej lub pipetowania i inkubuj reakcję przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Chronić płytkę przed światłem podczas inkubacji.
- W przypadku testów kolorymetrycznych zmierzyć absorbancję przy 570 nm (A570). W przypadku testów fluorometrycznych należy zmierzyć intensywność fluorescencji (λex = 535/λem = 587 nm)
Wyniki
Obliczenia
Tłem dla testów jest wartość uzyskana dla wzorca alaniny 0 (ślepa próba). Skoryguj tło, odejmując wartość ślepej próby od wszystkich odczytów. Wartości tła mogą być znaczące i należy je odjąć od wszystkich odczytów. Użyj wartości uzyskanych z odpowiednich wzorców alaniny do wykreślenia krzywej standardowej.
Uwaga: Nowa krzywa standardowa musi być ustawiona za każdym razem, gdy test jest uruchamiany.
Odejmij wartość ślepej próby od odczytu próbki, aby uzyskać skorygowany pomiar. Korzystając ze skorygowanego pomiaru, ilość alaniny obecnej w próbce można określić na podstawie krzywej standardowej.
Stężenie alaniny
Sa/Sv = C
Sa = Ilość alaniny w nieznanej próbce (nmole) z krzywej wzorcowej<
Sv = Objętość próbki (µL) dodana do studzienek
C = Stężenie alaniny w próbce
Masa cząsteczkowa L-alaniny: 89.09 g/mole.
Obliczenie próbki
Ilość alaniny (Sa) = 5.84 nmole
Objętość próbki (Sv) = 50 µL
Stężenie alaniny w próbce
5.84 nmole/50 µL = 0,1168 nmole/µL
0,1168 nmole/µL x 89,09 ng/nmole= 10,4 ng/µL
Stężenie alaniny w próbce
5.
Rysunek 1.Standardowa krzywa ColorImetric.
Rysunek 2.Fluorometryczna krzywa wzorcowa.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?