Test enzymatyczny katalazy (EC 1.11.1.6)

Opis

Ta procedura może być stosowana dla wszystkich produktów katalazy.

Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości redukcji (A₂₄₀, droga światła = 1 cm) opiera się na następującej reakcji:

Definicja jednostki: Jedna jednostka katalazy rozkłada 1,0 µmola H₂O₂ na minutę przy pH 7.0 w temperaturze 25°C, podczas gdy stężenie H₂O₂ spada z 10,3 mM do 9,2 mM. Szybkość zanikania H₂O₂ jest śledzona poprzez obserwację szybkości spadku absorbancji przy 240 nm.

Wymagane odczynniki i sprzęt

1.0 M dwuzasadowy roztwór fosforanu potasu (Numer katalogowy P8584)

1.0 M jednozasadowy roztwór fosforanu potasu (Numer katalogowy P8709)

Wodorotlenek potasu (Numer katalogowy P1767)

kwas chlorowodorowy (Numer katalogowy H1758)

Nadtlenek wodoru [30% (w/w), Numer katalogowy H1009]

Kuwety i spektrofotometr z termostatem

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego postępowania należy zapoznać się z kartą charakterystyki.

Instrukcje przygotowania (Przechowywanie/Stabilność)

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (≥18 MΩ×cm rezystywności w temperaturze 25 °C).

1. Bufor fosforanowy (50 mM bufor fosforanu potasu, pH 7.0 w 25 °C)
   Aby przygotować 200 ml:
   - Dodaj 6,15 ml 1.0 M dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu  (numer katalogowy P8584) do zlewki.
   - Dodaj 3.85 ml 1.0 M roztworu jednozasadowego fosforanu potasu  (numer katalogowy P8709).
   - Uzupełnij końcową objętość do 200 ml używając ultraczystej wody.
   - Dostosuj pH do 7,0 w 25 °C używając 1 M KOH lub HCl.
   
   
2. Roztwór nadtlenku wodoru [0.036% (w/w)] - Przygotować w buforze fosforanowym przy użyciu nadtlenku wodoru (30% (w/w), numer katalogowy H1009). Oznacz wartość A₂₄₀ tego roztworu, używając buforu fosforanowego jako próby ślepej. Wartość A₂₄₀ musi wynosić od 0,550 do 0,520 jednostek absorbancji. W razie potrzeby dodać nadtlenek wodoru w celu zwiększenia absorbancji lub bufor fosforanowy w celu zmniejszenia absorbancji. Przechowywać roztwór schłodzony na lodzie podczas oznaczania.
   
3. Roztwór katalazy -
   - Produkty katalazy dostarczane w postaci liofilizowanego proszku.
     a. Przygotować roztwór początkowy o stężeniu 10 mg/ml w zimnym buforze fosforanowym (roztwór będzie lekko mętny).
     b. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do ~100 jednostek/ml w zimnym buforze fosforanowym. Wtórne rozcieńczenie
         musi być przygotowywane za każdym razem od nowa.
   - Produkty katalazy dostarczane w postaci krystalicznej zawiesiny, takie jak numer katalogowy C30.
      a. Inkubować produkt w temperaturze 37°C przez ~1 godzinę, aby uzyskać całkowite rozpuszczenie.
      b. Używając pipety wyporowej, przygotować początkowe rozcieńczenie ~1000 jednostek/ml w buforze fosforanowym o temperaturze 37°C
       .
      c. Inkubować wstępne rozcieńczenie przez ~1 godzinę w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania rozpuszczenia (bez zawirowań).
      d. Bezpośrednio przed użyciem wykonać wtórne rozcieńczenie do ~100 jednostek/ml w buforze fosforanowym o temperaturze 37 °C.
         Wtórne rozcieńczenie musi być przygotowywane za każdym razem od nowa.

Procedura

Końcowe stężenia testu - W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,00 ml końcowe stężenia wynoszą ~50 mM fosforanu potasu, 0,036% (w/w) nadtlenku wodoru i ~10 jednostek katalazy.

1. Używając odpowiedniego termostatowanego spektrofotometru ustawionego na A₂₄₀ i 25 °C, wygasić przyrząd względem kuwety kwarcowej zawierającej bufor fosforanowy.
2. Dozuj pipetą 2,90 ml roztworu nadtlenku wodoru do kuwety kwarcowej.
   Uwaga: Przeprowadź tylko jeden test na raz.
3. Umieść kuwetę w spektrofotometrze i pozwól substratowi ustabilizować się do temperatury 25°C.
4. Następnie dodaj 0,10 ml roztworu katalazy do kuwety. Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i monitorować spadek absorbancji wykonując jeden odczyt na sekundę przez ~180 sekund.
5. Zapisać czas wymagany do spadku A₂₄₀ z 0.45 do 0,40 jednostek absorbancji.
6. Przeprowadź kroki 1-5 w trzech powtórzeniach.

Wyniki

Obliczenia

1.	Jednostki/mL enzymu =		(3.45) (df)
			(czas) (0.1)

Gdzie:

3.45 = odpowiada rozkładowi 3.45 µmoli nadtlenku wodoru w 3.0 ml mieszaniny reakcyjnej powodującemu spadek A₂₄₀ z 0.45 do 0.40
df = współczynnik rozcieńczenia
czas = minuty potrzebne do spadku A₂₄₀ z 0,45 do 0,40 jednostki absorbancji
0,1 = mililitr enzymu dodanego do kuwety

2.	Units/mg solid =		jednostki/mL enzymu
			mg stałe/mL enzymu

.

1. Beers Jr. R, Sizer I. 1952. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem.. 195(1):133-40.

2. Stern K. 1937. On the absorption spectrum of catalase. J. Biol. Chem.. 121561-72.