Bioluminescencyjne testy lucyferazy Firefly

Czym jest lucyferaza Firefly?

Lucyferaza Firefly jest szeroko stosowanym bioluminescencyjnym reporterem do badania regulacji i funkcji genów. Jest to bardzo czuły reporter genetyczny ze względu na brak endogennej aktywności lucyferazy w komórkach lub tkankach ssaków . Lucyferaza Firefly jest białkiem o masie 62 000 daltonów, które jest aktywne jako monomer i nie wymaga późniejszego przetwarzania dla swojej aktywności. Enzym katalizuje zależne od ATP utlenianie D-lucyferyny do oksylucyferyny, wytwarzając emisję światła wyśrodkowaną przy 560 nm. Światło emitowane z reakcji jest wprost proporcjonalne do liczby cząsteczek enzymu lucyferazy.

Rysunek 1. Zasada działania testu lucyferazy. Reakcja bioluminescencyjna katalizowana przez lucyferazę firefly wytwarza światło.

Jaka jest różnica między bioluminescencją a fluorescencją?

Bioluminescencja to proces chemiczny, w którym enzym rozkłada substrat (taki jak lucyferaza i D-lucyferyna), a jednym z produktów ubocznych tej reakcji jest światło. Bioluminescencja naturalnie występuje w przyrodzie u różnych glonów, bakterii, grzybów i niektórych zwierząt wodnych, takich jak meduzy. Fluorescencja jest procesem fizycznym, w którym światło wzbudza elektrony we fluoroforze do wyższego stanu energetycznego, a gdy elektron spada z powrotem do stanu podstawowego, emituje foton.

Jak działają testy lucyferazy?

Testy lucyferazy Firefly (SCT151, SCT154, LUC1, LUCASSY-RO) są przeznaczone do prostego i wydajnego oznaczania ilościowego aktywności enzymu reporterowego lucyferazy firefly z hodowanych komórek z wysoką czułością i liniowością. Jest to test luminescencji typu flash, który wymaga pomiaru sygnału natychmiast po dodaniu roztworu roboczego do próbek. Sygnał luminescencji zanika w ciągu około 10 minut czasu reakcji, chociaż okres półtrwania sygnału może się różnić w zależności od poziomu ekspresji lucyferazy.

Produkcja światła wynikająca z reakcji lucyferazy prowadzi do powstania samobójczej adenylo-oksylucyferyny na powierzchni enzymu. Skutkuje to bardzo krótkim okresem półtrwania emisji światła z kinetyką typu flash. Firefly Luciferase HTS Assay (SCT150) został zaprojektowany z wykorzystaniem zastrzeżonej mieszaniny substancji, które modyfikują reakcję enzymatyczną w celu wytworzenia długotrwałego sygnału (stały blask) poprzez zapobieganie tworzeniu się adenylo-oksylucyferyny na powierzchni enzymu. Jest to jednorodny zestaw o wysokiej czułości do oznaczania ilościowego ekspresji lucyferazy firefly w komórkach ssaków z okresem półtrwania sygnału wynoszącym około 3 godzin (Rysunek 2). Testy lucyferazy typu glow mają niższy sygnał luminescencji w porównaniu z testami typu flash. Czułość i granica wykrywalności testu będą zależeć od poziomu ekspresji lucyferazy w systemie eksperymentalnym, a także od czułości luminometru.

Rysunek 2. Miareczkowanie rekombinowanej lucyferazy firefly w teście lucyferazy firefly. A) Rekombinowana lucyferaza została seryjnie rozcieńczona w 1X buforze lizującym Firefly z 1 Mg/mL BSA i zmierzona w teście. B) Firefly Luciferase HTS Assay to zestaw do oznaczania ekspresji genu reporterowego lucyferazy Firefly o wysokiej czułości i stałym blasku, służący do ilościowego oznaczania ekspresji lucyferazy Firefly w komórkach ssaków z okresem półtrwania sygnału wynoszącym około 3 godzin.

Jaka jest różnica między lucyferazą Firefly i Renilla?

Testy lucyferazy Firefly wykorzystują lucyferynę w obecności tlenu, ATP i magnezu do wytwarzania światła (zielony/żółty, 550-70 nM), podczas gdy Renilla luciferase assays (SCT153) wymaga tylko koelenerazyny i tlenu do wytworzenia światła (niebieski, 480 nM). Renilla lucyferaza jest wykorzystywana jako gen reporterowy do badania regulacji i funkcji genów in vitro i in vivo. Jest on powszechnie stosowany w multipleksowych testach reporterowych transkrypcji lub jako normalizująca kontrola transfekcji w testach lucyferazy firefly. Enzym nie wymaga modyfikacji potranslacyjnej dla swojej aktywności i może funkcjonować jako reporter genetyczny bezpośrednio po translacji. Koelenerazyna, substrat dla lucyferazy Renilla , emituje również światło z utleniania niezależnego od enzymu, procesu znanego jako autoluminescencja. Autoluminescencja jest wzmacniana przez anion ponadtlenkowy i nadtlenoazotyn w komórkach i tkankach.

Rysunek 3. Lucyferaza Firefly vs. lucyferaza Renilla. Reakcje bioluminescencyjne katalizowane przez lucyferazę Firefly i lucyferazę Renilla.

Jakie są zalety testów z podwójną lucyferazą?

Test podwójnej lucyferazy Firefly/Renilla Dual Luciferase Assay (SCT152) umożliwia pomiar zarówno aktywności lucyferazy Firefly, jak i Renilla lucyferazy w tej samej próbce.) umożliwia pomiar aktywności lucyferazy Firefly i Renilla w tej samej próbce z wysoką czułością i liniowością. Najpierw mierzona jest aktywność lucyferazy Firefly, a następnie dodawany jest bufor Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0, aby jednocześnie wygasić aktywność lucyferazy Firefly i zmierzyć aktywność lucyferazy Renilla. Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0 wygasza aktywność lucyferazy firefly do poziomu nietransfekowanych komórek, umożliwiając sekwencyjny pomiar aktywności lucyferazy firefly i Renilla w tej samej próbce. Jest to test typu flash, który wymaga pomiaru luminescencji natychmiast po dodaniu odczynników wykrywających do próbki lucyferazy. Sygnał Firefly zanika w ciągu około 12 minut, podczas gdy sygnał Renilla zanika w ciągu około 2 minut, chociaż może się to różnić w zależności od poziomu enzymu.

Rysunek 4. Przegląd testu podwójnej lucyferazy. Przykład wykrywania lucyferazy Firefly i Renilla przy użyciu lizatów z nietransfekowanych komórek HeLa lub komórek transfekowanych samą lucyferazą Firefly (tylko Firefly) lub współtransfekowanych lucyferazami Firefly i Renilla (Firefly + Renilla). W komórkach transfekowanych tylko lucyferazą Firefly sygnał Renilla jest pozostałością luminescencji lucyferazy Firefly po dodaniu do reakcji roztworu roboczego lucyferazy Renilla.

Jakie są zastosowania testów lucyferazy?

• Reporter genowy

  Reportery genetyczne są wykorzystywane jako wskaźniki do badania zdarzeń komórkowych związanych z ekspresją genów. Zazwyczaj gen reporterowy jest klonowany z interesującą sekwencją DNA do wektora ekspresyjnego (który przenosi gen lucyferazy), który jest następnie przenoszony do komórek. Po przeniesieniu, komórki są badane na obecność reportera poprzez bezpośredni pomiar samego białka reporterowego lub aktywności enzymatycznej lucyferazy. Dobry gen reporterowy można łatwo zidentyfikować i zmierzyć ilościowo, gdy ulega on ekspresji (w organizmie lub komórkach będących przedmiotem zainteresowania).

  Na przykład, Sigma i SwitchGear Genomics™ połączyły siły, aby zaoferować wyłącznie ogólnogenomową kolekcję ponad 10 000 regionów 3′UTR w naszym zoptymalizowanym lentiwirusowym systemie wektorów reporterowych lucyferazy. Podczas przeprowadzania eksperymentów z użyciem MISSION^®3′UTR Lenti GoClones, w tym odpowiednie kontrole pozwalają na dokładną interpretację eksperymentalnych wyników ekspresji genów.

• Żywotność komórek poprzez wykrywanie ATP

  Ponieważ ATP jest wskaźnikiem metabolicznie aktywnych komórek, liczbę żywych komórek można ocenić na podstawie ilości dostępnego ATP. ATP Cell Viability Luciferase Assay (SCT149, 11699709001) oferuje wysoce czuły jednorodny test do ilościowego oznaczania ATP w hodowlach komórkowych. Zestaw ten wykorzystuje wykorzystanie ATP przez lucyferazę Firefly do utleniania D-Lucyferyny i wynikającej z tego produkcji światła w celu oceny ilości ATP dostępnego w hodowlach komórkowych. Procedura czułego testu obejmuje pojedyncze dodanie koktajlu wykrywającego ATP bezpośrednio do komórek hodowanych w pożywce uzupełnionej surowicą. Nie jest wymagane płukanie komórek, usuwanie pożywki i wielokrotne pipetowanie. Zestaw może być używany do wykrywania zaledwie jednej komórki lub 0,01 pikomola ATP. Wytwarzany sygnał jest liniowy w zakresie 6 rzędów wielkości. Odnosząc ilość ATP do liczby żywych komórek, test ma szerokie zastosowanie, począwszy od określenia liczby żywych komórek, poprzez proliferację komórek, aż po cytotoksyczność komórek.

Rysunek 5. Test żywotności komórek ATP. Lucyferaza Firefly wykorzystuje ATP do utleniania D-Lucyferyny i wynikającej z tego produkcji światła w celu oceny ilości dostępnego ATP, która koreluje z liczbą i żywotnością komórek.

• In vivo Imaging

  Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) stało się popularną techniką optycznego śledzenia komórek u małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy. Wraz z niską autofluorescencją tła i toksycznością komórkową, BLI może umożliwić jednoczesną wizualizację monitorowania ekspresji dwóch rozbieżnych białek lucyferazy poprzez wykorzystanie ich specyficznych substratów. Obrazowanie podwójnego genu lucyferazy (zoptymalizowanej pod kątem czerwonego kodonu lucyferazy firefly i zielonej lucyferazy click beetle) u tych samych zwierząt może zmniejszyć różnice wynikające z indywidualnych różnic zwierząt doświadczalnych.