Enzymy peroksydazy chrzanowej (HRP)

Nasza peroksydaza chrzanowa jest specjalnie wyselekcjonowana i uprawiana z korzeni chrzanu, a nasi hodowcy nieustannie wdrażają wieloletnią historię ulepszeń procesu, które zapewniają jakość, spójność i zoptymalizowaną wydajność. Od dziesięcioleci produkujemy peroksydazę w naszym zakładzie produkcyjnym ISO 9001:2000 w St. Louis w wielokilogramowych partiach. Podczas gdy podaż chrzanu w innych częściach świata była problemem, podaż chrzanu w Ameryce Północnej wzrosła. Nasz zakład produkcyjny w St. Louis wychodzi na obszar doliny Missisipi znany jako American Bottoms, który produkuje 60% światowego chrzanu.

Zakład produkcyjny ma doświadczoną, dobrze wyszkoloną siłę roboczą, która przestrzega rygorystycznych procedur operacyjnych w zakresie przetwarzania, sprzętu, czyszczenia, testowania i pakowania w ramach solidnych systemów jakości i zapewnienia jakości.

Nasza peroksydaza jest uznawana na całym świecie za standard branżowy w produkcji diagnostycznej i zastosowaniach badawczych na skalę laboratoryjną. Oferujemy różnorodne produkty w oparciu o czystość, zawartość izoform i modyfikacje kowalencyjne, aby sprostać ustalonym zastosowaniom, a także podstawowym potrzebom badawczym.

Czytaj więcej

• Funkcja i aktywność peroksydazy chrzanowej
• Charakterystyka produktu dla natywnej peroksydazy chrzanowej

Funkcja i aktywność peroksydazy chrzanowej

Specyficzna aktywność jest wyrażana w jednostkach pirogallolu. Jedna jednostka pirogallolu utworzy 1,0 mg purpurogaliny z pirogallolu w ciągu 20 s przy pH 6,0 w temperaturze 20° C, chyba że w wykazie wskazano inaczej. Ta jednostka purpurogaliny (20 s) jest równoważna ok. 18 µM jednostek na minutę w temperaturze 25°C.

Jednostki ABTS to kolejna powszechnie stosowana definicja jednostki. Jedna jednostka ABTS utlenia 1 µmol ABTS na minutę w temperaturze 25 °C przy pH 5,0. Używając ABTS jako substratu, obserwuje się około czterokrotnie wyższą aktywność w porównaniu z układem pirogallolu.

RZ (Reinheitszahz) to stosunek absorbancji A₄₀₃/A₂₇₅ określony przy 0,5-1,0 mg/ml w wodzie dejonizowanej. Jest to miara zawartości heminy i niekoniecznie wskazuje na aktywność enzymatyczną.

Charakterystyka produktu dla natywnej peroksydazy chrzanowej

Współczynnik ekstynkcji: E_mM = 100 przy pomiarze przy 403 nm.¹

Masa cząsteczkowa: (ok. 44 kDa)

Zawiera łańcuch polipeptydowy (33 890 Daltonów), heminę plus Ca²⁺ (ok. 700 Daltonów) i węglowodan (9400 Daltonów).³

Punkt izoelektryczny: Izozymy mieszczą się w zakresie 3,0 - 9,0

Istnieje co najmniej siedem izozymów HRP.²

Peroksydaza chrzanowa (HRP) jest izolowana z korzeni chrzanu (Amoracia rusticana) i należy do grupy peroksydaz ferroprotoporfirynowych. HRP jest jednołańcuchowym polipeptydem zawierającym cztery mostki dwusiarczkowe. Jest to glikoproteina zawierająca 18% węglowodanów. Skład węglowodanów obejmuje galaktozę, arabinozę, ksylozę, fukozę, mannozę, mannozaminę i galaktozaminę, w zależności od konkretnego izozymu.²

Specyficzność substratowa

HRP łatwo łączy się z nadtlenkiem wodoru (H₂O₂), a powstały kompleks [HRP-H₂O₂] może utleniać szeroką gamę chromogennych donorów wodoru. Może również wykorzystywać substraty chemiluminescencyjne, takie jak luminol i izoluminol, oraz substraty fluorogeniczne, takie jak tyramina, kwas homowanilinowy i kwas 4-hydroksyfenylooctowy.

 Enzyme Explorer's Substrate Index zawiera linki do kilku chromogennych i chemiluminescencyjnych donorów wodoru stosowanych do oznaczania aktywności peroksydazy.

Inhibitory

Następujące związki są inhibitorami peroksydazy chrzanowej: azydek sodu, cyjanek, L-cystyna, dichromian, etylenotiomocznik, hydroksyloamina, siarczek, wanadan, kwas p-aminobenzoesowy, Cd⁺², Co⁺², Cu⁺², Fe⁺³, Mn⁺², Ni⁺², Pb⁺².⁴

Zależność od pH

Optymalne pH HRP mieści się w zakresie od 6,0 do 6,5. Aktywność przy pH 7,5 wynosi 84% wartości maksymalnej. Enzym jest najbardziej stabilny w zakresie pH od 5,0 do 9,0.⁵

Zastosowania

Peroksydaza chrzanowa jest szeroko stosowana jako znakowanie immunoglobulin w wielu różnych zastosowaniach immunochemicznych, w tym ELISA, immunoblottingu i immunohistochemii. HRP może być sprzężona z przeciwciałami kilkoma różnymi metodami, w tym glutaraldehydem, utlenianiem periodatu, poprzez wiązania dwusiarczkowe, a także poprzez aminowe i tiolowe środki sieciujące. HRP jest najbardziej pożądanym znacznikiem dla przeciwciał, ponieważ jest najmniejszym i najbardziej stabilnym z trzech najpopularniejszych znaczników enzymatycznych (HRP, fosfataza alkaliczna i B-galaktozydaza), a jego glikozylacja prowadzi do niższego niespecyficznego wiązania.⁶ Protokoły opisujące metodologie koniugacji glutaraldehydu i peronianu można znaleźć w Harlow, E. et al.⁷

Oferujemy kilka chromogennych i chemiluminescencyjnych odczynników detekcyjnych do blottingu, histologii i ELISA zastosowań.

Oferujemy również kompletną linię przeciwciał sprzężonych z HRP.

Instrukcje przygotowania

Wybór rozpuszczalnika zależy od zamierzonego zastosowania. Sproszkowane enzymy są rozpuszczalne w wodzie lub 0,1 M buforze fosforanowym, pH 6 (10 mg/ml). zawiesina (P6140) może być rozcieńczona w wodzie.

Przechowywanie/Stabilność

Sproszkowane peroksydazy powinny być przechowywane w lodówce w temperaturze 2-8 °C. Przechowywanie w zamrażarce jest również dopuszczalne, ale nie jest wymagane. zawiesina (P6140) powinna być przechowywana w temperaturze 2-8°C. Przy prawidłowym przechowywaniu okres trwałości tych produktów wynosi co najmniej dwa lata.

RZ Profile

RZ (Reinheitszahl): stosunek absorbancji A₄₀₃/A₂₇₅. Jest to miara zawartości heminy w peroksydazie, a nie aktywności enzymu. Nawet preparaty o wysokiej wartości RZ mogą mieć niską aktywność enzymatyczną. Do koniugacji białek takich jak przeciwciała z peroksydazą należy wybrać peroksydazę o wartości RZ co najmniej 3,0.

Referencje

1. DELINCEE H, RADOLA BJ. 1975. Fractionation of Horseradish Peroxidase by Preparative Isoelectric Focusing, Gel Chromatography and Ion-Exchange Chromatography. Eur J Biochem. 52(2):321-330. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1975.tb04000.x

2. Shannon LM, Kay E, Lew JY. 1966. Peroxidase Isozymes from Horseradish Roots. Journal of Biological Chemistry. 241(9):2166-2172. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)96680-9

3. WELINDER KG. 1979. Amino Acid Sequence Studies of Horseradish Peroxidase. Amino and Carboxyl Termini, Cyanogen Bromide and Tryptic Fragments, the Complete Sequence, and Some Structural Characteristics of Horseradish Peroxidase C. Eur J Biochem. 96(3):483-502. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13061.x

4. Zollner H. 1993. Handbook of Enzyme Inhibitors. 2nd Ed., Part A: 367–368.

5. Schomberg, D, Salzmann, M, and Stephan, D. 1993. Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6.

6. Deshpande SS. 1996. Enzyme Immunoassays. https://doi.org/10.1007/978-1-4613-1169-0

7. Harlow, E, and Lane, D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 346–348 . Cold Spring Harbor Laboratory, .