Oczyszczanie plazmidowego DNA

Wprowadzenie do oczyszczania plazmidów

Ekstrakcja makrocząsteczek, takich jak DNA, RNA i białka, jest powszechna w badaniach biologii molekularnej. Proces ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych ewoluował od skomplikowanej i pracochłonnej procedury. Obecne metody oczyszczania kwasów nukleinowych zapewniają wysoką wydajność próbek, czystość i skalowalność biomolekuł przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym. Powszechnie stosowane są również zautomatyzowane systemy przeznaczone dla średnich i dużych laboratoriów.

Przygotowanie kwasów nukleinowych do oczyszczania plazmidów

Przygotowanie kwasów nukleinowych rozpoczyna się od procesu pobierania próbek (bakterii, tkanek i komórek zwierzęcych lub tkanek roślinnych). Aby uzyskać wysokiej jakości kwas nukleinowy, niezależnie od metody stosowanej do przygotowania DNA, próbki muszą być pobierane i traktowane w odpowiedni sposób. Ścieżka od pobrania próbki do oczyszczenia kwasu nukleinowego może obejmować pobranie próbki, transport, archiwizację, przechowywanie i oczyszczanie kwasów nukleinowych w ramach przepływu pracy (Rysunek 1).

Rysunek 1. Przepływ pracy dla pobierania, transportu, archiwizacji i oczyszczania próbek DNA.

Izolacja kwasu nukleinowego

Izolacja DNA obejmuje lizę błon komórkowych, usunięcie białek histonowych, RNA i lipidów oraz oczyszczenie. Różne dostępne metody ekstrakcji i oczyszczania są wyszczególnione w Tabeli 1.

Tabela 1. Przegląd metod izolacji kwasów nukleinowych.

Metody	Cechy
Metoda konwencjonalna
Metoda ekstrakcji alkalicznej (PLED35)	alkaliczna denaturacja chromosomalnego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej stosowana do izolacji plazmidowego DNA  proces odzyskiwania po odwirowaniu
Wirowanie w gradiencie gęstości z użyciem chlorku cezu (CsCl)	preparatywne ultrawirowanie DNA w gradiencie gęstości stosowane do izolacji plazmidowego DNA oczyszczony kwas nukleinowy musi być ponownie wytrącony alkoholem
Chromatografia oligp(dT)-celulozowa	oczyszczanie RNA duże ilości RNA z komórek ssaków
Ekstrakcja tiocyjanianu guanidyny-fenol-chloroform (30911)	jednoetapowa ekstrakcja ciecz - ciecz stosowana do ekstrakcji RNA z hodowanych komórek i większości tkanek zwierzęcych generuje wysoką wydajność w ciągu czterech godzin kolejny proces wykonywany przez wytrącanie izopropanolem
Ekstrakcja kwasów nukleinowych w fazie stałej
Macierze krzemionkowe*	do selektywnego wiązania DNA i oczyszczania DNA oczyszczone cząsteczki DNA mogą być później eluowane przy niskiej sile jonowej (pH ≥7) przy użyciu buforu Tris-EDTA lub wody destylowanej
Cząsteczki szklane	stosowane do oddzielania kwasu nukleinowego od innych substancji w obecności chaotropowego roztworu soli
Ziemia okrzemkowa (ziemia okrzemkowa lub ziemia okrzemkowa)	przydatna do oczyszczania plazmidu i innego DNA poprzez unieruchomienie DNA na cząstkach w obecności czynnika chaotropowego DNA jest wymywane buforem o niskiej zawartości soli lub wodą destylowaną
Materiał jonowymienny	interakcja pomiędzy dodatnio naładowanymi grupami dietyloaminoetylocelulozy (DEAE) na powierzchni żywicy i ujemnie naładowanymi fosforanami na powierzchni żywicy.a ujemnie naładowanymi fosforanami szkieletu DNA
* Produkty GenElute

Plazmidowe DNA

Plazmidy to małe, koliste, dwuniciowe DNA wykorzystywane w biologii molekularnej do manipulowania i dekodowania informacji genetycznej. Stały się one kluczowymi składnikami wszelkich technik klonowania i biotechnologicznych, ponieważ łatwiej nimi manipulować.

Opracowano różne metody oczyszczania plazmidowego DNA. Jesteśmy zaangażowani w dostarczanie bardziej ekologicznych produktów alternatywnych, które są zgodne z co najmniej jedną z 12 zasad bardziej ekologicznej chemii. Produkty GenElute mają z natury bezpieczniejszą chemię w porównaniu do standardowego użycia fenolu i chloroformu do ekstrakcji DNA.

Nasz zestaw do minipreparacji plazmidów GenElute™ to prosta, szybka i opłacalna metoda izolacji plazmidowego DNA z kultur E. coli. Zestaw łączy w sobie technologię membranową opartą na krzemionce i wygodę formatu kolumny wirówkowej i odzyskuje do 20 mg plazmidowego DNA o wysokiej kopi na mL hodowli nocnej. Poniżej przedstawiono główne etapy (Rysunek 2) izolacji i oczyszczania plazmidowego DNA przy użyciu GenElute™ Plasmid Miniprep Kit.

1. Komórki bakteryjne są zbierane poprzez wirowanie, poddawane zmodyfikowanej procedurze lizy alkaliczno-SDS, a DNA adsorbowane na krzemionce w obecności wysokich soli.
2. Zanieczyszczenia są następnie usuwane przez prosty etap płukania.
3. Związane DNA jest wymywane w wodzie lub buforze Tris-EDTA. Odzyskane plazmidowe DNA jest głównie w formie superzwiniętej.
4. DNA jest gotowe do użycia w aplikacjach takich jak trawienie enzymami restrykcyjnymi, klonowanie, PCR, transformacja, transkrypcja, konwencjonalne i zautomatyzowane sekwencjonowanie

Niektóre z naszych zestawów do oczyszczania plazmidowego DNA są zestawione w Tabeli 2. Szczegółowe wyjaśnienie różnych metod oczyszczania plazmidowego DNA (PDF).

Rysunek 2. Proces przygotowania kwasów nukleinowych i oczyszczania plazmidów. Oczyszczanie DNA PCR: numery produktów NA1020 i PCR9604

Tabela 2. Zestawy do oczyszczania plazmidowego DNA

Produkt Nr.	Nazwa produktu	Cechy
PLN10 PLN70 PLN350	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit	purify up to 20 µg plazmidowego DNA na ml hodowli oczyszczone plazmidowe DNA w mniej niż 30 minut dla maksymalnie 24 preps szybciej niż kolumny anionowymienne z przepływem grawitacyjnym nie wykrywa genomowego DNA.brak wykrywalnego zanieczyszczenia genomowym DNA lub RNA nie wymaga ekstrakcji fenolem/chloroformem ani wytrącania alkoholem zawiera dodatkowy bufor płuczący do stosowania z enda+ E. coli szczepami bakterii (np, hb101 jm101, bl21)
NA0150S NA0150 NA0160   NA0200S NA0200 NA0300S NA0300 NA0310	GenElute™ HP Plasmid Miniprep Kit	od zebranej kultury bakteryjnej do czystego plazmidowego DNA w 30 minut lub mniej do 25 µg (mini), 350 µg (midi) i 1.2 mg (maxi) wysokokopijnego plazmidowego DNA oferuje elastyczność formatu próżniowego lub wirówkowego nie wymaga ekstrakcji fenolem/chloroformem lub wytrącania alkoholem zestawy są stabilne w temperaturze pokojowej dla wygodnego przechowywania opłacalne
PLED35	GenElute™ Endotoxin-free Plasmid Midiprep Kit	purify up to 250 mg of endotoxin-free plasmid DNA (≤0.1 eu/μg DNA) szybkie i proste, pozwalające na przygotowanie do 12 preparatów w czasie krótszym niż 2 godziny szybsze niż kolumny jonowymienne z przepływem grawitacyjnym lub preparaty z kulek magnetycznych nie wymaga drogiego sprzętu magnetycznego
NA0500	GenElute™ HP Plasmid Megaprep Kit	wyrafinowany - najnowsza technologia zapewnia lepszą wydajność obfity - daje 5 mg wysokiej jakości, wolnego od endotoksyn (≤0.1eu/μg) plazmidowego DNA w 90 minut lub mniej wygodny - format próżniowy bez konieczności wytrącania etanolem
NA0400S NA0400 .NA0410	GenElute™ HP Endotoxin-free Plasmid Maxiprep Kit	szybki - od zebranej kultury bakteryjnej do czystego plazmidowego DNA w 40 minut elastyczny - wygodny format próżniowy nie wykorzystuje kolumn z przepływem grawitacyjnym wysoka wydajność - do 1.2 mg wysokokopijnego plazmidowego DNA z ≤0.1 eu/μg
.NA0600	GenElute™ HP Endotoxin-free Plasmid Megaprep Kit	szybki - od zebranej kultury bakteryjnej do czystego plazmidowego DNA w 90 minut wygodny - format próżniowy bez konieczności wytrącania etanolem wysoka wydajność - 5 mg wysokokopijnego plazmidowego DNA (≤0.1 eu/μg)
NA0800	GenElute™ HP Select Plasmid Gigaprep Kit	wyrafinowany - wykorzystuje technologię HP select, najlepszą metodę oczyszczania plazmidów wysoka wydajność - 15 mg wysokiej jakości, wolnego od endotoksyn (≤0.1 eu/μg) plazmidowego DNA w czasie 2 godzin lub krótszym wygodna - format próżniowy bez konieczności wytrącania etanolu wszechstronna - może być stosowana do oczyszczania plazmidów o niskim poziomie toksyczności. może być stosowany do oczyszczania plazmidowego DNA o niskiej, średniej i wysokiej kopii
NA0100	PhasePrep™ BAC DNA Kit	typowa wydajność DNA 2-100 μg z 5-500 ml hodowli nocnych nie wymaga ekstrakcji fenolem/chloroformem umożliwia przygotowanie od mikro do maxi przy użyciu tego samego zestawu

Tabela 3. Produkty do czyszczenia PCR

Numer produktu	Nazwa produktu
NA1020	Numer produktu	Nazwa produktu
NA1020	GenElute™ PCR Clean-Up Kit
PCR9604	GenElute™ 96 Well PCR Clean-Up Kit

Referencje

1. Tan SC, Yiap BC. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 20091-10. https://doi.org/10.1155/2009/574398

2. Buckingham L, Flaws ML. 2007. Flaws, Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods, & Clinical Applications. Philadelphia, USA: F.A. Davis Company.

3. Weaver R. 2002. Molecular Biology . 2nd edition. San Francisco: McGraw Hill.